對(duì)蝦桃拉綜(zōng)合症病毒（TSV）RNA核酸(suān)檢(jiǎn)測(cè)試(shì)劑盒（PCR-熒(yíng)光(guāng)探(tàn)針法）操作(zuò)方法

1樣(yàng)本的(dí)處理（在(zài)樣本製(zhì)備(bèi)區進行）：

1.1，取(qǔ) n 個(gè)滅(miè)菌(jūn)的 1.5 mL Eppendorf 管，其中 n 為(wéi)被檢樣(yàng)品(pǐn)與陰(yīn)性(xìng)對照的和（陽(yáng)性對(duì)照，陰(yīn)性對(duì)照在試劑盒中已標出），做(zuò)標(biāo)記。(注(zhù)：試劑盒(hé)中的陽性(xìng)對照直(zhí)接作為 PCR 檢測(cè)的(dí)模板，無需提(tí)取(qǔ)核(hé)酸(suān))

1.2，每管(guǎn)加入(rù) 600 L 裂解液，分別(bié)加入(rù)被檢樣本和(hé)陰(yīn)性對照各 200 L，一(yī)份樣(yàng)本(běn)換用(yòng)一個(gè)吸頭，再(zài)加入 200 L 氯仿(fǎng)，混匀(yún)器(qì)上振(zhèn)蕩(dàng)混(hùn)匀(yún) 5 s（不能過於強(qiáng)烈，以(yǐ)免產生乳(rǔ)化層，也可以(yǐ)用手顛倒混匀(yún)），於(yú) 4℃ 12 000 r/min 離心 15 min。

1.3，取(qǔ)與(yǔ)1.1 相(xiāng)同(tóng)數量滅菌(jūn)的(dí) 1.5 mL Eppendorf 管，加入(rù) 500 L 異丙(bǐng)醇(chún)（-20℃預冷(lěng)）， 做標記(jì)。吸取(qǔ)1.2 各管中(zhōng)的(dí)上清液(yè)轉移至(zhì)相(xiāng)應的管中，上清液(yè)應(yīng)至(zhì)少(shǎo)吸取 500L，不(bù)能(néng)吸(xī)出中間(jiān)層，顛倒混匀。

1.4，於 4 ℃，12 000 r/min 離(lí)心 15 min（Eppendorf 管開(kāi)口保持(chí)朝(zhāo)離心機(jī)轉軸方(fāng)向放置），小心倒去上(shàng)清，倒(dǎo)置於(yú)吸(xī)水(shuǐ)紙上(shàng)，沾幹(gān)液體(不(bù)同樣品(pǐn)須在吸水紙(zhǐ)不同地方沾(zhān)幹)；加入 600 L 75％ 乙醇(chún)，顛(diān)倒洗(xǐ)滌(dí)。1.5，於 4 ℃，12 000 r/min 離心 10 min（Eppendorf 管(guǎn)開(kāi)口保(bǎo)持(chí)朝(zhāo)離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放(fàng)置），小(xiǎo)心(xīn)倒去上(shàng)清，倒(dǎo)置於(yú)吸(xī)水紙上，盡量沾幹(gān)液體（不(bù)同樣(yàng)品須(xū)在吸水(shuǐ)紙不(bù)同(tóng)地方(fāng)沾幹）。

1.6，4 000 r/min 離心 10s（Eppendorf 管(guǎn)開口(kǒu)保持朝離心機(jī)轉軸方向(xiàng)放置(zhì)），將管壁(bì)上的殘餘液體甩到管(guǎn)底部，小心倒去(qù)上(shàng)清(qīng)，用微量(liáng)加樣器(qì)將其吸(xī)幹，一份樣(yàng)本換(huàn)用(yòng)一個吸(xī)頭(tóu)，吸(xī)頭不要(yào)碰到(dào)有(yǒu)沉(chén)澱(diàn)一(yī)麵(miàn)，室(shì)溫(wēn)幹(gān)燥 3 min，不(bù)能(néng)過於幹燥，以(yǐ)免 RNA 不溶。

1.7，加入(rù) 11 L DEPC 水(shuǐ)，輕(qīng)輕混(hùn)匀(yún)，溶解(jiě)管壁(bì)上的 RNA，2 000 r/min 離(lí)心 5 s，冰上保(bǎo)存(cún)備(bèi)用。提(tí)取的 RNA 須在 2 h 內進行(háng) PCR 擴(kuò)增(zēng)；若需(xū)長期保(bǎo)存(cún)須放置-70 ℃冰箱內。

【也可參(cān)照《病(bìng)毒(dú) RNA 柱(zhù)式提取試劑(jì)盒說明書(shū)》（貨(huò)號(hào)：HB-QPCR-01）使用，更(gēng)方便快捷提取核酸】。

注：提(tí)取的(dí) RNA 須在(zài) 2 h 內進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增；若需長(cháng)期保存須(xū)放置(zhì)-70 ℃冰箱內