技術服務(wù)
Western Blotting技(jì)術(shù)服務(wù)
Western Blotting技術服務
WESTERN BLOT是以電(diàn)泳(yǒng)分離(lí)組(zǔ)分，將其(qí)從凝膠轉移到一(yī)種固相(xiāng)支持(chí)體，繼(jì)之以(yǐ)針對特定(dìng)氨(ān)基酸序列(liè)的特異(yì)性抗體作為(wéi)探針檢(jiǎn)測目的蛋白的一種分(fēn)子生(shēng)物學(xué)技術。
免(miǎn)疫印跡(immunoblotting)又(yòu)稱蛋白質印跡(Western blotting)，它是(shì)根據(jù)抗(kàng)原抗體的特異(yì)性結合檢(jiǎn)測(cè)復(fù)雜樣品(pǐn)中的某種(zhǒng)蛋白的方法。該(gāi)法是在(zài)凝膠(jiāo)電泳和固(gù)相免疫測定技術(shù)基礎上(shàng)發(fā)展(zhǎn)起來的一種(zhǒng)新的免疫(yì)生(shēng)化技術(shù)。由(yóu)於(yú)免(miǎn)疫印(yìn)跡具有SDS-PAGE的高(gāo)分辨(biàn)力和(hé)固相免疫(yì)測定的高特異性和敏感(gǎn)性，現(xiàn)已成為(wéi)蛋白分析的一(yī)種常(cháng)規技術。免疫印跡(jì)常用於(yú)鑒(jiàn)定某種(zhǒng)蛋白，並能(néng)對蛋白進行(háng)定(dìng)性(xìng)和半(bàn)定量(liáng)分析(xī)。
我司為您(nín)提(tí)供全(quán)套(tào)免疫(yì)印跡(jì)(immunoblotting)技(jì)術服(fú)務，全部(bù)實驗皆(jiē)使(shǐ)用高(gāo)質(zhì)量試劑(jì)完成
●主(zhǔ)要實驗(yàn)步驟(zhòu)如(rú)下(xià)：
1. 蛋(dàn)白(bái)質抽(chōu)提(tí)
a.實驗(yàn)對(duì)象(xiàng)為組織樣品，取適量(liáng)（250~500mg）新(xīn)鮮(xiān)組織(zhī)樣(yàng)品或(huò)正確(què)保存的(dí)組織(zhī)樣(yàng)品，加(jiā)1ml含蛋白酶(méi)抑(yì)製劑(jì)的總(zǒng)蛋白抽提(tí)試(shì)劑（或核(hé)蛋白(bái)抽提試劑(jì)），匀(yún)漿後(hòu)抽(chōu)提總(zǒng)蛋(dàn)白（或(huò)核蛋白）。
b.實驗(yàn)對象為細(xì)胞樣品(pǐn)，每(měi)份(fèn)樣品(pǐn)取1×106～1×107細(xì)胞，PBS清洗細胞，去PBS加(jiā)0.1ml~1ml含(hán)蛋白(bái)酶(méi)抑製劑的總蛋白抽提(tí)試劑（或(huò)核(hé)蛋(dàn)白(bái)抽(chōu)提(tí)試(shì)劑）抽提(tí)總蛋(dàn)白（或核(hé)蛋白）。
2. 蛋(dàn)白質定量
按(àn)KCTMBCA蛋白質定(dìng)量試(shì)劑盒操作說明(míng)操(cāo)作，測定樣品(pǐn)濃度。
3. 變性聚丙(bǐng)烯酰胺(àn)不(bù)連(lián)續凝膠電(diàn)泳(yǒng)(SDS-PAGE)
將(jiāng)準備好(hǎo)的樣(yàng)品(pǐn)液和(hé)生物素(sù)標記的蛋(dàn)白質分子(zǐ)量標準(zhǔn)分別上(shàng)樣，標準加進第一個孔(kǒng)中(zhōng)，電泳(yǒng)分(fēn)離蛋(dàn)白(bái)。
4. 蛋白質轉移到硝酸纖(xiān)維膜或PVDF膜
按(àn)Bio-Rad蛋白轉移裝置(zhì)說(shuō)明組裝濾紙凝膠(jiāo)纖維(wéi)素(sù)夾(jiā)層，30mA恒流條(tiáo)件(jiàn)下，4°C轉(zhuǎn)移(yí)過夜。
5. 膜(mó)的封閉(bì)和抗(kàng)體孵(fū)育(yù)
a. 膜在5％BSA溶(róng)液中室(shì)溫(wēn)孵(fū)育1小時(shí)以(yǐ)封閉膜上(shàng)的非特異(yì)結合。
b. 封閉(bì)過(guò)的(dí)膜加入一(yī)級(jí)抗(kàng)體(tǐ)室溫孵(fū)育1.5小時(shí)，抗原抗(kàng)體結合。
c. 加入HRP標記的二(èr)級抗(kàng)體(tǐ)以結(jié)合一(yī)級抗體(tǐ)及HRP標(biāo)記的(dí)抗生(shēng)物素抗體(tǐ)以(yǐ)結(jié)合(hé)分(fēn)子量標(biāo)準，室溫孵(fū)育(yù)膜(mó)1小(xiǎo)時(shí)。加入HRP標記的GAPDH抗體可同(tóng)時檢測(cè)GAPDH含(hán)量(liáng)。
6. 結(jié)果檢(jiǎn)測(cè)
化(huà)學發光法(fǎ)檢(jiǎn)測，膜與(yǔ)化(huà)學發光底物(wù)孵育(yù)，經(jīng)X膠片曝光(guāng)顯影。圖(tú)片掃(sǎo)描(miáo)保(bǎo)存(cún)為電(diàn)腦(nǎo)文件，並用ImageJ分析軟(ruǎn)件(jiàn)將圖片上(shàng)每(měi)個(gè)特(tè)異(yì)條(tiáo)帶(dài)灰度(dù)值的(dí)數字(zì)化。
7. 數據分析
目的(dí)蛋白(bái)的灰(huī)度值除以內參GAPDF的灰(huī)度值以(yǐ)校正誤(wù)差(chà)，所得(dé)結果(guǒ)代表(biǎo)某樣(yàng)品的目的(dí)蛋(dàn)白相(xiāng)對(duì)含(hán)量。
8. 提(tí)供實驗報告
包括(kuò)詳細的(dí)實(shí)驗方法(fǎ)及(jí)免疫(yì)印(yìn)跡(jì)實驗結(jié)果的相關圖表。
客戶(hù)方需(xū)提(tí)供(gōng)：
1， 第(dì)一抗(kàng)體(建(jiàn)議客戶定購(gòu)國外(wài)公(gōng)司的(dí)一抗，以(yǐ)國外(wài)文(wén)獻(xiàn)中(zhōng)應用的相關第(dì)一抗(kàng)體(tǐ)為(wéi)佳。
如(rú)Cell signaling technology, Cayman Chemical, Santan Cruz, Zymed等著(zhù)名抗(kàng)體(tǐ)公司(sī)。)
2， 預(yù)實驗(yàn)樣本
3， 正式實(shí)驗樣本(běn)
同(tóng)時(shí)希望(wàng)客(kè)戶能(néng)提供(gōng)相應的背(bèi)景(jǐng)材料以利實(shí)驗順(shùn)利完成，背(bèi)景(jǐng)材料包(bāo)括：樣本描述，目的蛋(dàn)白相關(guān)資(zī)料(liào)，必要(yào)的(dí)相關(guān)實(shí)驗設(shè)計內(nèi)容如陽(yáng)性(xìng)對照等(děng)等。
★ 公司方(fāng)提(tí)供：
1， 預(yù)實驗結果
2， 正(zhèng)式實驗結(jié)果(guǒ)
如客戶隻需(xū)要(yào)進行(háng)預實(shí)驗(yàn)研究，我方(fāng)可隻(zhī)代(dài)理預實驗業務並提(tí)供結(jié)果。
★ 實驗周(zhōu)期與費用(yòng)：
預實驗(yàn)的費用以欲檢測目(mù)的蛋白的種類(lèi)數目（或第一抗體種類數目(mù)）計算(suàn)，公(gōng)司將在(zài)材(cái)料和(hé)實驗經(jīng)費全部到(dào)位(wèi)的(dí)工作日後(hòu)15個(gè)工作(zuò)日之內(nèi)提交實驗(yàn)結果。正(zhèng)式實驗費(fèi)用欲檢測目的蛋白(bái)的種(zhǒng)類數目（或(huò)第一抗(kàng)體種類(lèi)數目）和(hé)樣本(běn)數為(wéi)單位(wèi)計(jì)算，實(shí)驗周(zhōu)期(qī)為(wéi)20個工作(zuò)日(rì)，公司將(jiāng)在材(cái)料和(hé)預付的實(shí)驗(yàn)經費(fèi)全部(bù)到位的(dí)工作日後20個工(gōng)作(zuò)日之內提(tí)交實驗結果。如客戶要求(qiú)在(zài)10個工(gōng)作(zuò)日(rì)之內(nèi)完成，每(měi)單位樣(yàng)品費(fèi)用(yòng)為常規(guī)周期的兩(liǎng)倍。實驗結(jié)果以(yǐ)膠(jiāo)片的形式提交給客戶(hù)，客戶需在收到實驗結果(guǒ)後(hòu)一周(zhōu)內(nèi)付清(qīng)所(suǒ)有剩餘(yú)款項。
