東(dōng)部馬(mǎ)腦脊髓炎病毒(dú)PCR檢測(cè)試劑盒反應流程(chéng)常規程序(xù):

1．復性(xìng)（退火(huǒ)）和(hé)延伸溫度

復(fù)性的(dí)溫(wēn)度(dù)是(shì)PCR擴增(zēng)是否順(shùn)利(lì)的關(guān)鍵(jiàn)因(yīn)素(sù)，通(tōng)常(cháng)在50-60℃之間(jiān)。具(jù)體(tǐ)的溫度主要由引(yǐn)物(wù)的(dí)Tm值決定。延伸溫(wēn)度(dù)絕大多數(shù)設定為72℃。如(rú)果(guǒ)復性的溫度(dù)很高，可以將延(yán)伸溫度(dù)和復性(xìng)溫(wēn)度(dù)設(shè)置(zhì)成同(tóng)一(yī)溫度(dù)，變(biàn)成二步(bù)法(fǎ)PCR。

2．反(fǎn)應時間

變性步(bù)驟一般使用(yòng)30秒(miǎo)鐘(zhōng)，如(rú)果(guǒ)模(mó)板的G+C含量較高，或(huò)直接用細(xì)胞做(zuò)模(mó)板，變(biàn)性時間(jiān)可(kě)適當延長。復(fù)性(xìng)時(shí)間(jiān)有30秒種(zhǒng)一般是(shì)足夠(gòu)的。延(yán)伸(shēn)時間(jiān)由擴增產物的(dí)大(dà)小決定(dìng)，一般(bān)采(cǎi)用(yòng)1kb用1分(fēn)鐘來保證充足的時間(jiān)。

3．循環(huán)次(cì)數

循環次數(shù)主要與(yǔ)模板的起始數量有(yǒu)關(guān)，在模板(bǎn)拷貝(bèi)數為(wéi)104～105數(shù)量級(jí)時，循環數通常為(wéi)25～35次。

平(píng)台效應（plateaueffect）：PCR擴增(zēng)過程後期會(huì)出現的產物的積累(léi)按減弱的指數速率增(zēng)長(cháng)的現象。原因：底(dǐ)物和引(yǐn)物(wù)的(dí)濃(nóng)度(dù)已經降低，dNTP和DNA聚(jù)合(hé)酶(méi)的(dí)穩定性或(huò)活性降低，產生的(dí)焦磷酸(suān)會(huì)出(chū)現(xiàn)末端(duān)產物抑製(zhì)作(zuò)用，非特異性(xìng)產物(wù)或引(yǐn)物(wù)的(dí)二聚體出現非特異性競爭(zhēng)作(zuò)用，擴增產物自身(shēn)復(fù)性(xìng)，高(gāo)濃(nóng)度擴(kuò)增產(chǎn)物變(biàn)性(xìng)不(bù)徹(chè)底。

4．PCR反(fǎn)應液(yè)的配製(zhì)

PCR反應體係(xì)的(dí)配置方式有(yǒu)時也會影響反應(yīng)的(dí)正(zhèng)常進(jìn)行。常(cháng)規(guī)方法與(yǔ)其它酶學反應一樣，在(zài)最後加(jiā)入DNA聚合酶(méi)。早期的PCR儀沒有帶(dài)加(jiā)熱的蓋(gài)子，要求在(zài)反(fǎn)應液上覆(fù)蓋(gài)一層礦物油，防(fáng)止(zhǐ)水分蒸發。

對於使(shǐ)用具3’-5’外(wài)切(qiē)活性的高溫DNA聚(jù)合酶時，有時會擴增(zēng)不(bù)出(chū)產物。在遇(yù)到(dào)這(zhè)個問題時(shí)，如果將(jiāng)反應成分分開(kāi)配製，A管含(hán)模(mó)板(bǎn)，引物(wù)和dNTP，以及(jí)調(tiáo)整體(tǐ)積(jī)的(dí)H2O，B管含(hán)緩(huǎn)衝液，DNA聚合(hé)酶和(hé)水，然後(hòu)再(zài)將(jiāng)兩管溶液混(hùn)合(hé)起(qǐ)來，可較(jiào)好(hǎo)地克(kè)服這(zhè)個(gè)問(wèn)題(tí)。
將PCR反應(yīng)所需的(dí)成分配置(zhì)完(wán)後，在PCR儀上(shàng)於(yú)94-96℃預加熱幾十秒(miǎo)至幾(jī)分鐘，使(shǐ)模板(bǎn)DNA充分變(biàn)性，然(rán)後進(jìn)入擴增循環(huán)。在每一個(gè)循(xún)環(huán)中(zhōng)，先於94℃保持30秒鐘使(shǐ)模板變性，然後將溫度(dù)降(jiàng)到復性溫度(dù)（一(yī)般(bān)50-60℃之(zhī)間(jiān)），一般(bān)保持(chí)30秒(miǎo)鐘，使引物(wù)與模板充(chōng)分退火；在72℃保(bǎo)持1分鐘（擴增1kb片(piàn)段(duàn)），使引物在模板上延伸，合成DNA，完(wán)成一(yī)個(gè)循環。重復這樣的循環25～35次，使(shǐ)擴增的DNA片段(duàn)大(dà)量(liáng)累積(jī)。最後(hòu)，在(zài)72℃保持3-7min，使產(chǎn)物延(yán)伸(shēn)完(wán)整，4℃保存。
按(àn)照常(cháng)規的(dí)方法(fǎ)配製(zhì)反應體係，有(yǒu)時會(huì)出(chū)現非特異性擴增的(dí)問題。熱(rè)啟動（hotstart）PCR操作(zuò)方(fāng)式(shì)可較(jiào)好解決(jué)這一問(wèn)題(tí)。將dNTP，緩(huǎn)衝(chōng)液，Mg2+和(hé)primer先配(pèi)製(zhì)好，然後加(jiā)入(rù)一粒蠟珠（如AmpliWaxPCRQam100），加熱(rè)熔化，再冷卻，使(shǐ)蠟(là)將溶(róng)液封住(zhù)，最(zuì)後加入模板和(hé)DNA聚合酶等剩餘(yú)成分(fēn)。隻有當(dāng)PCR反(fǎn)應(yīng)進入(rù)高溫(wēn)階段(duàn)後(hòu)，蠟(là)層熔(róng)化(huà)，所(suǒ)有(yǒu)反(fǎn)應成分(fēn)才會混(hùn)合在一起。