小(xiǎo)鼠垂(chuí)體腺(xiàn)苷(gān)酸(suān)環(huán)化(huà)酶激活(huó)肽(PACAP)elisa試(shì)劑(jì)盒(hé)說(shuō)明書

試驗原理(lǐ)：

TRH試劑(jì)盒是固相夾(jiā)心法酶聯免(miǎn)疫(yì)吸(xī)附實驗（ELISA）.已(yǐ)知(zhī)TRH濃度的(dí)標(biāo)準(zhǔn)品，未知濃度(dù)的(dí)樣品加入(rù)微孔酶標(biāo)板(bǎn)內進(jìn)行檢(jiǎn)測。先(xiān)將TRH和生(shēng)物素標(biāo)記的抗體同時(shí)溫(wēn)育(yù)。洗滌後(hòu)，加(jiā)入(rù)親和(hé)素(sù)標記(jì)過(guò)的HRP。再經(jīng)過(guò)溫(wēn)育和洗滌(dí)，去(qù)除(chú)未(wèi)結合的酶結合物，然後加(jiā)入底物(wù)A，B，和酶結合(hé)物同時作用。產(chǎn)生顏色。顏(yán)色(sè)的深淺和樣(yàng)品(pǐn)中TRH的濃度呈(chéng)比(bǐ)例關(guān)係。

試劑盒內(nèi)容及(jí)其配製(zhì)

試(shì)劑(jì)盒(hé)成份（2-8℃保存(cún)） 96孔配置(zhì) 48孔配(pèi)置(zhì) 配(pèi)製

96/48人(rén)份(fèn)酶(méi)標板 1塊板（96T） 半(bàn)塊板(bǎn)（48T） 即用(yòng)型

塑料(liào)膜板蓋(gài) 1塊 半塊(kuài) 即用(yòng)型(xíng)

標(biāo)準品：24ng/ml 1瓶(píng)（0.6ml） 1瓶（0.3ml） 按(àn)說(shuō)明(míng)書(shū)進(jìn)行(háng)稀(xī)稀

空白對照 1瓶(píng)（1.0ml） 1瓶（0.5ml） 即用(yòng)型

標準(zhǔn)品(pǐn)稀釋(shì)緩衝(chōng)液 1瓶(píng)（5ml） 1瓶(píng)（2.5ml） 即(jí)用型

生物(wù)素標記的抗TRH抗(kàng)體 1瓶（6ml） 1瓶（3.0ml） 即用(yòng)型(xíng)

親(qīn)和鏈(liàn)酶(méi)素-HRP 1瓶(píng)（10ml） 1瓶(píng)（5.0ml） 即(jí)用(yòng)型

洗滌緩衝液 1瓶(píng)（20ml） 1瓶(píng)（10ml） 按(àn)說(shuō)明(míng)書進行(háng)稀(xī)釋(shì)

底物(wù)A 1瓶(píng)（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即用(yòng)型

底物(wù)B 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即(jí)用型

終(zhōng)止液(yè) 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即(jí)用(yòng)型(xíng)

自備(bèi)材(cái)料(liào)

1． 蒸(zhēng)餾水。

2． 加樣(yàng)器：5ul，10ul，50ul，100ul，200，500ul，1000ul。

3． 振(zhèn)蕩器(qì)及(jí)磁力攪拌(bàn)器(qì)等。

安(ān)全性(xìng)

1． 避免(miǎn)直接接觸(chù)終止(zhǐ)液和底(dǐ)物A，B。一旦接觸(chù)到這些液(yè)體，請(qǐng)盡(jìn)快用水(shuǐ)衝洗(xǐ)。

2． 實(shí)驗(yàn)中不要(yào)吃喝，抽煙或(huò)使用化(huà)妝品(pǐn)。

3． 不要(yào)用嘴吸取試(shì)劑(jì)盒裏(lǐ)的任何(hé)成(chéng)份。

操作注意(yì)事項(xiàng)

1． 試劑(jì)應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲存(cún)，使用前恢復(fù)到(dào)室(shì)溫。稀(xī)稀(xī)過後的(dí)標準品(pǐn)應(yīng)丟棄，不(bù)可(kě)保存(cún)。

2． 實驗(yàn)中(zhōng)不(bù)用的板條應(yīng)立即放回包裝袋(dài)中(zhōng)，密(mì)封保(bǎo)存(cún)，以(yǐ)免(miǎn)變質。

3． 不(bù)用(yòng)的其它試(shì)劑(jì)應(yīng)包裝(zhuāng)好(hǎo)或蓋(gài)好。不同批號的試(shì)劑不要(yào)混用。保(bǎo)質(zhì)前(qián)使(shǐ)用。

4． 使用一次性的吸頭以免交叉(chā)汙染，吸(xī)取(qǔ)終止(zhǐ)液和底物(wù)A，B液時，避免(miǎn)使(shǐ)用帶金屬部分的加(jiā)樣器。

5． 使用幹淨(jìng)的(dí)塑料(liào)容器(qì)配置洗滌液。使用前充(chōng)分混(hùn)匀試劑(jì)盒裏的(dí)各種成份(fèn)及(jí)樣品(pǐn)。

6． 洗滌(dí)酶標板(bǎn)時(shí)應充分拍幹，不要將吸水紙(zhǐ)直(zhí)接(jiē)放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水(shuǐ)。

7． 底物(wù)A應揮發，避免長(cháng)時(shí)間(jiān)打開(kāi)蓋子(zǐ)。底物B對光(guāng)敏感(gǎn)，避免長時間(jiān)暴露(lòu)於光(guāng)下。避(bì)免用手接觸(chù)，有毒。實驗完成(chéng)後(hòu)應立即(jí)讀取(qǔ)OD值。

8． 加入(rù)試劑(jì)的順序應(yīng)一致(zhì)，以(yǐ)保證所有反(fǎn)應板孔(kǒng)溫育(yù)的時(shí)間(jiān)一(yī)樣。

9． 按照(zhào)說(shuō)明書(shū)中(zhōng)標明(míng)的時(shí)間(jiān)，加液的量(liáng)及(jí)順序(xù)進(jìn)行溫育操作。

樣(yàng)品收(shōu)集(jí)，處(chǔ)理及保存方(fāng)法(fǎ)

1， 血(xiě)清(qīng)-----操作過程中(zhōng)避(bì)免任(rèn)何細(xì)胞(bāo)刺(cì)激。使用不(bù)含(hán)熱(rè)原(yuán)和(hé)內(nèi)毒(dú)素的試(shì)管。收集血(xiě)液(yè)後，1000×g離心10分(fēn)鐘(zhōng)將(jiāng)血清和(hé)紅細胞迅(xùn)速小心地(dì)分離。

2， 血(xiě)漿(jiāng)-----EDTA，檸檬酸鹽，肝(gān)素(sù)血漿(jiāng)可用於檢測。1000×g離(lí)心(xīn)30分(fēn)鐘(zhōng)去除顆(kē)粒(lì)。

3， 細(xì)胞上(shàng)清液---1000×g離心10分鐘去(qù)除(chú)顆粒(lì)和聚合物(wù)。

4， 保存------如(rú)果樣品不(bù)立即使用，應(yīng)將其分成小部分(fēn)-70 ℃保存(cún)，避免(miǎn)反復冷(lěng)凍(dòng)。盡可能的不要(yào)使(shǐ)用溶(róng)血或高血脂(zhī)血。如果血清(qīng)中大(dà)量顆(kē)粒(lì)，檢(jiǎn)測前先離(lí)心或過濾(lǜ)。不要(yào)在37℃或(huò)更高的(dí)溫(wēn)度加熱(rè)解凍。應在(zài)室溫下(xià)解(jiě)凍並確保(bǎo)樣品(pǐn)均(jūn)匀地充分解凍(dòng)。

試(shì)劑(jì)的準(zhǔn)備

1． 標(biāo)準品：標準(zhǔn)品的係(xì)列稀(xī)釋應在(zài)實(shí)驗時(shí)準備，不能儲存(cún)。稀(xī)釋(shì)前將標(biāo)準品(pǐn)振(zhèn)蕩(dàng)混(hùn)匀。稀釋比例(lì)按下表(biǎo)中進(jìn)行(háng)：

24 ng/ml （6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品） 原(yuán)倍(bèi)濃度不(bù)用稀(xī)釋直(zhí)接(jiē)加入50ul。

12 ng/ml （5號標準品） 100ul的原倍(bèi)標準品(pǐn)加(jiā)入100ul的標準(zhǔn)品稀(xī)釋液(yè)

6.0 ng/ml （4號標準品） 100ul的(dí)5號標準(zhǔn)品加(jiā)入100ul的(dí)標準品稀釋液(yè)

3.0 ng/ml （3號標準品） 100ul的(dí)4號(hào)標準品(pǐn)加入100ul的(dí)標準品稀釋(shì)液(yè)

1.5 ng/ml （2號標準品） 100ul的3號(hào)標準(zhǔn)品(pǐn)加入100ul的標準品稀(xī)釋(shì)液

0.75 ng/ml （1號標準(zhǔn)品(pǐn)） 100ul的(dí)2號(hào)標準(zhǔn)品(pǐn)加(jiā)入100ul的(dí)標準品(pǐn)稀釋液

0 ng/ml （空白對(duì)照） 原(yuán)始(shǐ)濃度(dù)不用稀釋(shì)直接加(jiā)入(rù)50ul。

2． 洗(xǐ)滌緩(huǎn)衝(chōng)液（50×）的(dí)稀釋：蒸(zhēng)餾水(shuǐ)50倍(bèi)稀釋(shì)。

操(cāo)作(zuò)步(bù)驟

1． 使(shǐ)用(yòng)前(qián)，將所有試劑(jì)充(chōng)分混匀。不要(yào)使(shǐ)液(yè)體產生大量的泡沫，以(yǐ)免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加(jiā)樣(yàng)上(shàng)的(dí)誤差。

2． 根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加(jiā)上(shàng)標準品的數(shù)量(liáng)決定所需的(dí)板條數(shù)。每個標(biāo)準品和空(kōng)白孔(kǒng)建(jiàn)議做(zuò)復(fù)孔。每個樣(yàng)品根(gēn)據(jù)自(zì)己的(dí)數(shù)量來定(dìng)，能使用復孔(kǒng)的(dí)盡量(liáng)做(zuò)復(fù)孔。

3． 加入(rù)稀釋好後的(dí)標準品(pǐn)50ul於反應(yīng)孔，加入待(dài)測(cè)樣品50ul於(yú)反(fǎn)應孔內(nèi)。立(lì)即加入50ul的生(shēng)物素標記的抗體(tǐ)。蓋上膜(mó)板(bǎn)，輕輕(qīng)振(zhèn)蕩(dàng)混(hùn)匀，37℃溫(wēn)育1小時(shí)。

4． 甩去(qù)孔內液體，每孔(kǒng)加滿洗滌液(yè)，振(zhèn)蕩(dàng)30秒，甩去洗滌液，用吸(xī)水紙拍(pāi)幹。重復此操作(zuò)3次(cì)。如果(guǒ)用(yòng)洗(xǐ)板(bǎn)機洗滌，洗(xǐ)滌(dí)次數增加(jiā)一次。

5． 每(měi)孔加入(rù)80ul的親和鏈酶素-HRP，輕(qīng)輕(qīng)振蕩混匀，37℃溫(wēn)育30分鐘。

6． 甩(shuǎi)去孔(kǒng)內液體(tǐ)，每(měi)孔加滿洗滌液，振(zhèn)蕩(dàng)30秒，甩去洗(xǐ)滌(dí)液，用吸(xī)水紙拍(pāi)幹。重(zhòng)復此操作3次(cì)。如(rú)果(guǒ)用(yòng)洗板機洗滌，洗滌次數增(zēng)加(jiā)一次(cì)。

7． 每孔(kǒng)加(jiā)入底(dǐ)物A，B各(gè)50ul，輕輕(qīng)振(zhèn)蕩混匀(yún)，37℃溫(wēn)育(yù)10分(fēn)鐘(zhōng)。避(bì)免(miǎn)光照。

8． 取出酶(méi)標板(bǎn)，迅速(sù)加入(rù)50ul終止液，加入(rù)終止液(yè)後(hòu)應(yīng)立即測定(dìng)結(jié)果。

9． 在(zài)450nm波長(cháng)處(chǔ)測(cè)定各(gè)孔(kǒng)的OD值(zhí)。

建議使(shǐ)用的(dí)實驗方(fāng)案(àn)

標準品濃(nóng)度(dù)（ng/ml）

A 24 24 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品(pǐn)

B 12 12 樣(yàng)品 樣品 樣品 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品(pǐn)

C 6.0 6.0 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品 樣品 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣品

D 3.0 3.0 樣品 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品 樣品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣(yàng)品

E 1.5 1.5 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣品 樣品 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品 樣品 樣品 樣品

F 0.75 0.75 樣(yàng)品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品(pǐn)

G 0 0 樣品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品

H 樣(yàng)品 樣品 樣品 樣品 樣(yàng)品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣品(pǐn) 樣品 樣品 樣品 樣(yàng)品(pǐn)

局限

6號(hào)標準(zhǔn)品以上的結果為非綫(xiàn)性(xìng)的(dí)，根據此標準(zhǔn)曲綫無(wú)法得(dé)到的(dí)結果。

試(shì)劑(jì)盒性(xìng)能

1. 靈敏(mǐn)度：zui小的檢測濃度小於1號標準品。稀(xī)釋度的綫性。樣品綫性回(huí)歸(guī)與預期(qī)濃度(dù)相關(guān)係(xì)數R值為0.990。

2. 特(tè)異性(xìng)：不與其它細胞(bāo)因子(zǐ)反(fǎn)應。

3. 重復性(xìng)：板(bǎn)內(nèi)，板間(jiān)變(biàn)異係數均(jūn)小於(yú)10%。

結 果 判 斷 與 分 析(xī)

1，儀器值(zhí)：於(yú)波(bō)長(cháng)450nm的(dí)酶標儀(yí)上(shàng)讀取各孔(kǒng)的OD值

2，以(yǐ)吸(xī)光度OD值(zhí)為縱坐標(biāo)（Y），相應(yīng)的TRH標準品濃(nóng)度為橫坐標(biāo)（X），做(zuò)得相應的曲(qū)綫(xiàn)，樣(yàng)品(pǐn)的(dí)TRH含量(liáng)可(kě)根(gēn)據其OD值由(yóu)標(biāo)準曲(qū)綫(xiàn)換(huàn)算(suàn)出相應的濃度。

3，檢測值範圍：0-24ng/ml

4，敏(mǐn)感(gǎn)度： 0.1 ng/ml