產(chǎn)品特征(zhēng):
 
靈(líng)敏度(dù)高
：能(néng)對低(dī)拷貝或多(duō)樣(yàng)性模(mó)板進行定量。
特異性(xìng)強(qiáng)
：采(cǎi)用(yòng)熱啟(qǐ)動(dòng)酶的激活機製(zhì)，抑製(zhì)非特異(yì)性擴增 。
重復(fù)性好
：擴增曲綫(xiàn)重合(hé)度(dù)高(gāo)，受幹擾影響少。
擴增效率高
：擴(kuò)增(zēng)曲(qū)綫Ct值低，起峰(fēng)快，效(xiào)率高。
原(yuán)理:
所謂(wèi)實時(shí)熒(yíng)光定量(liáng)PCR技術(shù)，是(shì)指(zhǐ)在(zài)PCR反(fǎn)應體係中加(jiā)入熒光(guāng)基(jī)團，利用(yòng)熒光(guāng)信(xìn)號積累(léi)實時監測(cè)整(zhěng)個(gè)PCR進程，後通過(guò)標(biāo)準曲綫對(duì)未(wèi)知模板(bǎn)進(jìn)行(háng)定量分析的(dí)方(fāng)法(fǎ)。
需要自(zì)備的(dí)器(qì)材
：
1．儀器
：分(fēn)析(xī)天平
，離(lí)心(xīn)機(jī)
，熒(yíng)光(guāng) PCR 擴(kuò)增儀(yí)
，組(zǔ)織(zhī)研磨(mó)器
，-20 ℃冰(bīng)箱(xiāng)
，可(kě)調移液(yè)器(qì)（2 µL
，20µL
，200 µL
，1000 µL）。
2．耗材(cái)
：熒光(guāng) PCR 反應管(guǎn)
，眼科剪(jiǎn)
，眼科鑷
，生理鹽水(shuǐ)
，1.5 mL 經焦碳酸二(èr)乙酯（DEPC）水(shuǐ)
處(chǔ)理(lǐ)的(dí)滅菌離(lí)心管(guǎn)
，吸(xī)頭（10 µL
，200 µL
，1000 µL）
，滅菌(jūn)雙(shuāng)蒸水(shuǐ)。
具(jù)有下列特點(diǎn)
：
1.產品僅用於科(kē)研即(jí)開(kāi)即用(yòng)，用(yòng)戶隻(zhī)需要提供樣品 DNA 模板，操(cāo)作簡(jiǎn)單(dān)，定量準確快速。
2. 引物(wù)經過(guò)優(yōu)化，特異性強(qiáng)。預期的 PCR 產物長(cháng)度為(wéi) 560 bp。
3. PCR mix 中含(hán)上(shàng)樣染料(liào)，PCR 後可(kě)以(yǐ)直接(jiē)上(shàng)樣電泳。
4. 提供(gōng)陽性對照(zhào)，便於分析試驗(yàn)結果。
檢(jiǎn)測方(fāng)法
：
1.Ⅰ法
：
在PCR反應(yīng)體係中(zhōng)，加(jiā)入(rù)過量SYBR熒光(guāng)染(rǎn)料，SYBR熒(yíng)光(guāng)染(rǎn)料特異性地摻入DNA雙鏈後，發射熒(yíng)光(guāng)信(xìn)號(hào)，而不摻入鏈(liàn)中的SYBR染料分(fēn)子不(bù)會發(fā)射(shè)任何熒光(guāng)信(xìn)號，從(cóng)而保證熒光信(xìn)號的增加(jiā)與PCR產物的(dí)增(zēng)加(jiā)wan全同步。
定量(liáng)PCR擴增熒光(guāng)曲綫(xiàn)圖
PCR產(chǎn)物熔解曲綫(xiàn)圖(tú)
2.TaqMan探針法(fǎ)
：
探針(zhēn)完整(zhěng)時(shí)，報告基(jī)團發射(shè)的熒光信(xìn)號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收(shōu)
；PCR擴增(zēng)時，Taq酶的5’-3’外切(qiē)酶活(huó)性將探針(zhēn)酶(méi)切(qiē)降(jiàng)解，產(chǎn)品(pǐn)僅(jǐn)用(yòng)於科(kē)研使報告熒(yíng)光基團(tuán)和淬滅(miè)熒光(guāng)基團(tuán)分(fēn)離，從而(ér)熒(yíng)光監測係統(tǒng)可(kě)接(jiē)收到熒(yíng)光信(xìn)號，即每擴增(zēng)一條DNA鏈，就有一(yī)個熒光分(fēn)子(zǐ)形成(chéng)，實現(xiàn)了(liǎo)熒光信號(hào)的累積與PCR產物的(dí)形成(chéng)wan全同步。
熒光(guāng)定(dìng)量PCR實驗步(bù)驟
：
①取凍(dòng)存已(yǐ)裂(liè)解(jiě)的細胞(bāo)，室溫放置5分(fēn)鐘(zhōng)使其(qí)wan全溶解(jiě)。
②兩(liǎng)相分(fēn)離 每1ml的(dí)TRIZOL試劑裂解的(dí)樣(yàng)品(pǐn)中加(jiā)入0.2ml的lvfang，蓋緊管(guǎn)蓋。手(shǒu)動劇烈(liè)振(zhèn)蕩管(guǎn)體(tǐ)15秒後，15到30℃孵育(yù)2到3分(fēn)鐘。4℃下(xià)12000rpm離(lí)心(xīn)15分鐘。離心(xīn)後混合(hé)液體將分為(wéi)下(xià)層(céng)的紅色(sè)酚(fēn)lvfang相，中(zhōng)間層以及無色水(shuǐ)相上(shàng)層。RNA全部(bù)被分配於(yú)水(shuǐ)相(xiāng)中。水相上層的體積大約(yuē)是匀(yún)漿時(shí)加(jiā)入的TRIZOL試劑的60%。
③RNA沉澱(diàn) 將(jiāng)水(shuǐ)相上層(céng)轉移(yí)到一幹淨無(wú)RNA酶(méi)的離(lí)心管中。加等體積(jī)異(yì)丙醇(chún)混合(hé)以(yǐ)沉(chén)澱其(qí)中(zhōng)的(dí)RNA，混匀(yún)後15到30℃孵育10分(fēn)鐘後，於4℃下12000rpm 離心(xīn)10分鐘(zhōng)。此時離(lí)心前不(bù)可見的(dí)RNA沉(chén)澱(diàn)將(jiāng)在管(guǎn)底部(bù)和(hé)側壁上(shàng)形(xíng)成膠狀沉(chén)澱(diàn)塊。
④RNA清(qīng)洗(xǐ) 移(yí)去上(shàng)清液(yè)，每(měi)1mlTRIZOL試(shì)劑裂(liè)解(jiě)的樣品中(zhōng)加入(rù)至少1ml的75%乙醇(chún)(75%乙(yǐ)醇(chún)用(yòng)DEPCH2O配製)，清洗RNA沉(chén)澱。混(hùn)匀後(hòu)，4℃下7000rpm離心5分(fēn)鐘。
⑤RNA幹(gān)燥 小心吸(xī)去大(dà)部(bù)分乙醇(chún)溶液，使RNA沉澱在(zài)室溫(wēn)空氣(qì)中(zhōng)幹燥5-10分鐘(zhōng)。
⑥溶解(jiě)RNA沉澱 溶解RNA時(shí)，先(xiān)加(jiā)入無RNA酶(méi)的水(shuǐ)40μl用槍反復吹打(dǎ)幾次，使其wan全溶解(jiě)，獲得的RNA溶液(yè)保存於(yú)-80℃待(dài)用。 1)紫外吸收法測定(dìng)先用稀釋用的(dí)TE溶(róng)液將(jiāng)分光(guāng)光度(dù)計調零。然後(hòu)取少(shǎo)量RNA溶(róng)液(yè)用TE稀(xī)釋(1:100)後，讀(dú)取其在(zài)分光(guāng)光度(dù)計260nm和(hé)280nm處(chǔ)的吸收值，測(cè)定(dìng)RNA溶(róng)液 濃度(dù)和純(chún)度。反應(yīng)五(wǔ)要素
：
斯氏分枝杆菌PCR檢測試(shì)劑盒(hé)費(fèi)用(yòng)參加PCR反應(yīng)的物質主要有五種(zhǒng)即引物(wù)
，酶(méi)
，dNTP
，模板和(hé)Mg2+
引物(wù)
：引物是PCR特異性(xìng)反應(yīng)的關鍵(jiàn)，PCR 產物(wù)的(dí)特異(yì)性取(qǔ)決(jué)於引物與(yǔ)模板DNA互(hù)補的(dí)程(chéng)度(dù)。理論(lùn)上，隻要(yào)知道任何(hé)一(yī)段(duàn)模(mó)板(bǎn)DNA序(xù)列(liè)， 就能按其(qí)設(shè)計(jì)互(hù)補(bǔ)的(dí)寡核(hé)苷酸(suān)鏈做(zuò)引(yǐn)物(wù)，利用PCR就可將(jiāng)模(mó)板DNA在(zài)體外大(dà)量擴(kuò)增。設(shè)計引物應(yīng)遵(zūn)循以下(xià)原則
：
①引物長度(dù)
： 15-30bp，常(cháng)用為20bp左右。
②引物擴(kuò)增跨度
： 以200-500bp為宜，特(tè)定條件下(xià)可(kě)擴增長(cháng)至10kb的片段。
③引(yǐn)物(wù)鹼(jiǎn)基
：G+C含(hán)量以40-60%為(wéi)宜，G+C太(tài)少(shǎo)擴(kuò)增(zēng)效果不(bù)佳，G+C過(guò)多(duō)易(yì)出現(xiàn)非特異(yì)條帶。ATGC隨機(jī)分(fēn)布(bù)，避免5個以上的嘌呤(líng)或(huò)嘧啶(dìng)核苷(gān)酸(suān)的(dí)成(chéng)串排列。
④避免(miǎn)引(yǐn)物內部(bù)出現(xiàn)二(èr)級(jí)結構(gòu)，避免兩條(tiáo)引(yǐn)物(wù)間互補，特別是(shì)3'端(duān)的(dí)互(hù)補，否則(zé)會形(xíng)成引(yǐn)物二聚體(tǐ)，產生非(fēi)特(tè)異的擴增條(tiáo)帶(dài)。
⑤引物(wù)3'端的鹼(jiǎn)基，特(tè)別是末(mò)及倒數第二個(gè)鹼基(jī)，應(yīng)嚴格(gé)要求(qiú)配(pèi)對，以避(bì)免因末端(duān)鹼基不配(pèi)對而導致PCR失敗。
⑥引(yǐn)物(wù)中(zhōng)有或能加上(shàng)合適(shì)的酶(méi)切(qiē)位(wèi)點(diǎn)， 被擴增的靶序(xù)列有(yǒu)適宜(yí)的(dí)酶(méi)切(qiē)位(wèi)點(diǎn)， 這(zhè)對酶切(qiē)分析(xī)或(huò)分子克(kè)隆很有好處(chǔ)。
⑦引(yǐn)物(wù)的特(tè)異(yì)性
：引物(wù)應(yīng)與(yǔ)核酸(suān)序列(liè)數(shù)據庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源(yuán)性。
引(yǐn)物量
：每(měi)條引物(wù)的濃度0.1～1umol或(huò)10～100pmol，以(yǐ)低引物(wù)量(liáng)產生所(suǒ)需要的(dí)結(jié)果(guǒ)為(wéi)好，引(yǐn)物(wù)濃度(dù)偏高(gāo)會(huì)引(yǐn)起錯配和(hé)非(fēi)特(tè)異性擴增(zēng)，且(qiě)可增(zēng)加(jiā)引物(wù)之間形(xíng)成二(èr)聚體的(dí)機會(huì)。
 
 實(shí)驗(yàn)注(zhù)意事項(xiàng)
：
 
1）RT-PCR可以(yǐ)檢測組(zǔ)織
，細(xì)胞
，血液(yè)
，細菌等很多(duō)材料，不(bù)同的(dí)樣本(běn)有(yǒu)不(bù)同要求，實驗(yàn)前請充分(fēn)溝(gōu)通確(què)認實(shí)驗方(fāng)案和(hé)樣(yàng)本(běn)情(qíng)況(kuàng)
；
 
2）客戶(hù)盡(jìn)可能(néng)提供(gōng)實驗的(dí)背(bèi)景信息(xī)
，物(wù)種
，基(jī)因準(zhǔn)確(què)的名(míng)稱(chēng)和(hé)ID號
；
 
3）客(kè)戶盡量不要(yào)提供(gōng)DNA或(huò)RNA樣(yàng)品。
 
4）樣本保(bǎo)存(cún)於液氮(dàn)或幹(gān)冰，也可(kě)以(yǐ)保存(cún)於(yú)Trizol液中(zhōng)。
 
實時(shí)熒光定量(liáng)PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是指(zhǐ)在PCR反應體(tǐ)係中加(jiā)入(rù)熒(yíng)光(guāng)基團，利用(yòng)熒(yíng)光信號積(jī)累(léi)實時(shí)監測整個PCR進(jìn)程(chéng)，*通(tōng)過標(biāo)準曲綫(xiàn)對未知模板進(jìn)行定量(liáng)分析(xī)的方(fāng)法。實時熒(yíng)光(guāng)定(dìng)量PCR的化(huà)學(xué)原理包(bāo)括探針類和(hé)非探針(zhēn)類兩類，探(tàn)針(zhēn)類是利用(yòng)與靶細胞序列(liè)特(tè)異(yì)性(xìng)雜(zá)交的探針來(lái)指(zhǐ)示(shì)擴(kuò)增產(chǎn)物的(dí)增加(jiā)，非(fēi)探(tàn)針類是利用熒光染料或者(zhě)特(tè)異(yì)性設計的引物來指(zhǐ)示擴(kuò)增(zēng)的(dí)增(zēng)加(jiā)。運用該技術(shù)可以對DNA
，RNA樣品(pǐn)進行(háng)定量（包括(kuò)*定(dìng)量和相對(duì)定(dìng)量）和(hé)定(dìng)性分析。
 
主要(yào)服(fú)務
：DNA或(huò)RNA的*定量(liáng)分(fēn)析
，基(jī)因(yīn)表達差異分析
，基(jī)因分型(xíng)。
 
主(zhǔ)要技(jì)術
：引(yǐn)物(wù)設(shè)計(jì)
，RNA提取(qǔ)
，cDNA合(hé)成
，qPCR。