羊(yáng)邊界(jiè)病(bìng)病毒(dú)探針法(fǎ)熒光定量(liáng)RT-PCR試(shì)劑盒(hé)實(shí)驗步驟：
①取(qǔ)凍存(cún)已裂(liè)解(jiě)的細(xì)胞(bāo)
，室溫(wēn)放置(zhì)5分(fēn)鐘使其*溶解。
②兩(liǎng)相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂(liè)解(jiě)的(dí)樣品(pǐn)中加入0.2ml的(dí)lvfang
，蓋(gài)緊管蓋。手(shǒu)動劇烈(liè)振蕩管體(tǐ)15秒後
，15到30℃孵(fū)育2到3分鐘。4℃下(xià)12000rpm離(lí)心15分(fēn)鐘。離(lí)心後混合液(yè)體將(jiāng)分為(wéi)下(xià)層的(dí)紅(hóng)色(sè)酚lvfang相
，中(zhōng)間(jiān)層以(yǐ)及無(wú)色水相上層(céng)。RNA全(quán)部(bù)被分配於水相中(zhōng)。水(shuǐ)相上(shàng)層(céng)的體(tǐ)積(jī)大(dà)約是匀(yún)漿(jiāng)時(shí)加入(rù)的(dí)TRIZOL試(shì)劑(jì)的(dí)60%。
③RNA沉澱 將水相(xiāng)上(shàng)層轉(zhuǎn)移到一(yī)幹(gān)淨(jìng)無RNA酶(méi)的離心管(guǎn)中。加等(děng)體(tǐ)積(jī)異(yì)丙(bǐng)醇混(hùn)合(hé)以沉澱(diàn)其中(zhōng)的RNA
，混匀後15到(dào)30℃孵(fū)育10分(fēn)鐘後
，於4℃下(xià)12000rpm 離心10分(fēn)鐘。此時(shí)離(lí)心(xīn)前不可(kě)見的RNA沉(chén)澱將在管(guǎn)底部和側壁上形(xíng)成膠(jiāo)狀沉澱塊。
④RNA清(qīng)洗 移(yí)去(qù)上清(qīng)液
，每(měi)1mlTRIZOL試(shì)劑(jì)裂解(jiě)的(dí)樣品(pǐn)中(zhōng)加入至(zhì)少1ml的(dí)75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配製)
，清(qīng)洗RNA沉澱(diàn)。混(hùn)匀後
，4℃下(xià)7000rpm離心(xīn)5分(fēn)鐘(zhōng)。
⑤RNA幹(gān)燥 小心(xīn)吸去(qù)大部分乙(yǐ)醇(chún)溶液
，使RNA沉澱在室溫空氣中幹燥5-10分鐘。
⑥溶(róng)解RNA沉(chén)澱 溶解RNA時(shí)
，先(xiān)加入無RNA酶(méi)的水40μl用槍反(fǎn)復吹(chuī)打(dǎ)幾次(cì)
，使其*溶(róng)解
，獲(huò)得(dé)的RNA溶(róng)液保存於-80℃待用。 1)紫外吸(xī)收法測定先(xiān)用(yòng)稀(xī)釋(shì)用的TE溶液(yè)將(jiāng)分(fēn)光光度(dù)計(jì)調零。然(rán)後(hòu)取少量RNA溶(róng)液用TE稀(xī)釋(shì)(1:100)後(hòu)
，讀取(qǔ)其在分(fēn)光光(guāng)度計260nm和280nm處的吸收值(zhí)
，測(cè)定(dìng)RNA溶液 濃度和(hé)純(chún)度(dù)。