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大量(liáng)植(zhí)物RNA提(tí)取試劑盒(含(hán)DNA清(qīng)除(chú)柱)實驗(yàn)步驟(zhòu)
大量植(zhí)物RNA提(tí)取(qǔ)試劑盒(含(hán)DNA清除柱(zhù))實(shí)驗步驟:
(1)實驗開始前將(jiāng)RNA提(tí)取液於65℃水浴鍋(guō)中(zhōng)預(yù)熱,離心(xīn)管中加入ME(巰基(jī)乙醇),(10mL加80ul,50mL中(zhōng)加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲(sī)體(tǐ)(液(yè)體(tǐ)培養(yǎng)獲得(dé)的菌(jūn)絲用真(zhēn)空(kōng)抽(chōu)濾即(jí)可!固(gù)體(tǐ)培養就(jiù)更好說了),在(zài)液氮中(zhōng)迅(xùn)速(sù)磨成(chéng)精細(xì)粉(fěn)末(mò),裝(zhuāng)入(rù)50mL離心(xīn)管,按1g材料8mL的量(liáng)加(jiā)入(rù)預(yù)熱(rè)的(dí)RNA提取液(yè),顛倒(dǎo)混匀(yún)
(3)65℃水浴(yù)3-10 min,期(qī)間混(hùn)匀2-3次(cì)
(4)加入等(děng)體(tǐ)積(jī)的酚(注(zhù)意是酸酚(fēn)pH4.5)::異(yì)戊醇(chún)(25:24:1)抽(chōu)提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取(qǔ)上清(qīng),等體積的(dí):異戊(wù)醇(24:1)抽(chōu)提(tí)(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入(rù)1/4V體積10M LiCl溶液(yè),4℃放(fàng)置6h以(yǐ)上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離(lí)心(xīn)20min
(8)棄(qì)上(shàng)清(qīng),用(yòng)500ul SSTE溶解沉澱
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提(tí)兩(liǎng)次,:異戊醇(24:1)抽(chōu)提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的(dí)無(wú)水(shuǐ)乙(yǐ)醇(chún),在(zài)-70℃冰箱沉澱30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄(qì)上清(qīng).沉(chén)澱(diàn)用70%酒(jiǔ)精漂洗一次,幹(gān)燥(zào)
(13)加200ul的DEPC處理水溶解(jiě)
(14)用(yòng)非(fēi)變性(xìng)瓊脂糖凝(níng)膠電泳和紫外(wài)分光光度計掃描檢測(cè)RNA的(dí)質(zhì)量
(在(zài)抽提過(guò)程中,若蛋白質含量或(huò)其它(tā)的雜質還(huán)較多,可(kě)以(yǐ)增(zēng)加抽(chōu)提(tí)次數)
(1)實驗開始前將(jiāng)RNA提(tí)取液於65℃水浴鍋(guō)中(zhōng)預(yù)熱,離心(xīn)管中加入ME(巰基(jī)乙醇),(10mL加80ul,50mL中(zhōng)加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲(sī)體(tǐ)(液(yè)體(tǐ)培養(yǎng)獲得(dé)的菌(jūn)絲用真(zhēn)空(kōng)抽(chōu)濾即(jí)可!固(gù)體(tǐ)培養就(jiù)更好說了),在(zài)液氮中(zhōng)迅(xùn)速(sù)磨成(chéng)精細(xì)粉(fěn)末(mò),裝(zhuāng)入(rù)50mL離心(xīn)管,按1g材料8mL的量(liáng)加(jiā)入(rù)預(yù)熱(rè)的(dí)RNA提取液(yè),顛倒(dǎo)混匀(yún)
(3)65℃水浴(yù)3-10 min,期(qī)間混(hùn)匀2-3次(cì)
(4)加入等(děng)體(tǐ)積(jī)的酚(注(zhù)意是酸酚(fēn)pH4.5)::異(yì)戊醇(chún)(25:24:1)抽(chōu)提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取(qǔ)上清(qīng),等體積的(dí):異戊(wù)醇(24:1)抽(chōu)提(tí)(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入(rù)1/4V體積10M LiCl溶液(yè),4℃放(fàng)置6h以(yǐ)上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離(lí)心(xīn)20min
(8)棄(qì)上(shàng)清(qīng),用(yòng)500ul SSTE溶解沉澱
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提(tí)兩(liǎng)次,:異戊醇(24:1)抽(chōu)提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的(dí)無(wú)水(shuǐ)乙(yǐ)醇(chún),在(zài)-70℃冰箱沉澱30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄(qì)上清(qīng).沉(chén)澱(diàn)用70%酒(jiǔ)精漂洗一次,幹(gān)燥(zào)
(13)加200ul的DEPC處理水溶解(jiě)
(14)用(yòng)非(fēi)變性(xìng)瓊脂糖凝(níng)膠電泳和紫外(wài)分光光度計掃描檢測(cè)RNA的(dí)質(zhì)量
(在(zài)抽提過(guò)程中,若蛋白質含量或(huò)其它(tā)的雜質還(huán)較多,可(kě)以(yǐ)增(zēng)加抽(chōu)提(tí)次數)
