兔(tù)

兔(tù)心(xīn)肌(jī)成纖維細胞(bāo)分離(lí)自心髒組(zǔ)織(zhī)；心(xīn)髒由(yóu)心肌細胞(bāo)和非(fēi)心肌細胞組(zǔ)成(chéng)，非(fēi)心肌細胞占細胞總數(shù)量的(dí)約70%，其中(zhōng)約(yuē)90%以上(shàng)的非心肌(jī)細(xì)胞由(yóu)心(xīn)肌成(chéng)纖(xiān)維細(xì)胞組成，在不(bù)同(tóng)物種（如(rú)小鼠，大(dà)鼠和(hé)人(rén)類(lèi)）中(zhōng)可能略(lüè)有差異。“成纖(xiān)維細(xì)胞(bāo)” 指(zhǐ)一(yī)類存(cún)在於間(jiān)質中的異(yì)質性高遷(qiān)移基質(zhì)細(xì)胞，其功能和表型(xíng)具(jù)有(yǒu)組織特異性。在心髒中，心髒(zàng)成(chéng)纖維(wéi)細胞(bāo)負(fù)責維(wéi)持(chí)組織穩(wěn)態並調控細(xì)胞外(wài)基質（ECM）的更新。目前(qián)尚(shàng)無完全特(tè)異性的心髒成(chéng)纖維(wéi)細胞分子(zǐ)標(biāo)誌(zhì)物(wù)，但這類細(xì)胞通(tōng)常表達轉錄因(yīn)子(zǐ) 21（TCF21），波形(xíng)蛋白（vimentin）及 CD90（或(huò) Thy-1）。心肌成(chéng)纖維細胞(bāo)在(zài)生物學特(tè)性上與肝星(xīng)狀細(xì)胞(bāo)存在顯(xiǎn)著共(gòng)性(xìng)，二(èr)者(zhě)均(jūn)以“靜息-激活”的功能狀態(tài)轉(zhuǎn)換為(wéi)核心(xīn)特(tè)征(zhēng)，且(qiě)狀態(tài)轉(zhuǎn)換緊密關(guān)聯細胞的增殖活性與功能實現。當(dāng)受(shòu)到(dào)應激(jī)或(huò)損(sǔn)傷時，成(chéng)纖維細胞會(huì)失去(qù)正(zhèng)常表型並活化成為肌成纖維(wéi)細胞。靜息心肌成(chéng)纖維細胞的細胞骨架中不含 α- 平滑(huá)肌(jī)肌動(dòng)蛋(dàn)白（α-SMA）。與靜(jìng)息成(chéng)纖(xiān)維(wéi)細(xì)胞不同，肌成纖維(wéi)細(xì)胞收(shōu)縮(suō)能(néng)力強(qiáng)，其細(xì)胞骨架(jià)排(pái)列特殊，含有(yǒu)α-SMA陽性(xìng)應力纖維 ，成(chéng)熟(shú)黏著斑，並(bìng)會增加骨膜(mó)蛋白(bái)（periostin）和(hé)纖維(wéi)狀(zhuàng)膠原蛋(dàn)白(bái)的合(hé)成。有研究表(biǎo)明，在(zài)模擬天(tiān)然(rán)組(zǔ)織特(tè)性的(dí)彈性表(biǎo)麵培(péi)養原代成(chéng)纖(xiān)維(wéi)細(xì)胞有助於減輕肌成纖維(wéi)細胞的(dí)活化(huà)。對於(yú)心肌(jī)組織而言(yán)，彈(dàn)性模量(liáng)（E）約(yuē)為7 kPa的(dí)培養表(biǎo)麵(miàn)模擬(nǐ)健(jiàn)康(kāng)組(zǔ)織(zhī)，而E>10 kPa的表麵則(zé)被視為纖維化組織。這構成了(liǎo)一(yī)個顯著挑(tiāo)戰(zhàn)，因為傳(chuán)統聚苯乙烯(xī)組(zǔ)織(zhī)培養板的(dí)硬度要高得多，通(tōng)常(cháng)可(kě)達E=3 GPa。此外，雖(suī)然傳代原代(dài)細胞(bāo)以提高(gāo)培養群體(tǐ)均一(yī)性(xìng)是(shì)常規操作，但(dàn)傳代(dài)會進(jìn)一步(bù)驅動(dòng)肌成纖維(wéi)細胞(bāo)活化(huà)。原代(dài)心肌成纖(xiān)維(wéi)細胞在(zài)傳統細(xì)胞培養中接(jiē)種數小(xiǎo)時內就(jiù)會(huì)自(zì)發呈(chéng)現促(cù)纖(xiān)維化的活化肌(jī)成纖(xiān)維(wéi)細(xì)胞表(biǎo)型(xíng)。有研(yán)究表明，在低(dī)營養，低血清，細胞(bāo)接(jiē)種(zhǒng)在低(dī)生物力學(xué)刺(cì)激的彈(dàn)性(xìng)基(jī)質（而非堅(jiān)硬(yìng)塑料）上(shàng)，可(kě)使未傳代（P0）原代(dài)心肌(jī)成(chéng)纖(xiān)維(wéi)細胞在(zài)體(tǐ)外維持超(chāo)過(guò)72小時，且(qiě)不會(huì)顯著活化(huà)肌(jī)成纖維(wéi)細胞表型，但其維(wéi)持效(xiào)果仍(réng)然(rán)有(yǒu)限。實(shí)驗室(shì)分離的心肌成(chéng)纖維細(xì)胞(bāo)，經(jīng)實(shí)驗測試，剛分(fēn)離後(hòu)即立刻接(jiē)種(zhǒng)在培(péi)養(yǎng)板/爬片，培養24 h約(yuē)70-90%占比細(xì)胞表達(dá)Vimentin處(chǔ)於靜息態（其(qí)他處(chǔ)於激活(huó)態(tài)），培養(yǎng)48 h約>70%轉(zhuǎn)變為(wéi)激活(huó)態，α-SMA表達上(shàng)升(shēng)。傳(chuán)代操作(zuò)後大部分處(chǔ)於(yú)激活態。該(gāi)細胞(bāo)鑒(jiàn)定為接種(zhǒng)24 h內靜息(xī)態(tài)時刻(kè)鑒定（Vimentin/α-SMA），細胞經(jīng)培養，運輸後已處於激(jī)活態。

自備試劑(jì)
： 0.25%胰蛋白酶(méi)  ，PBS  ，完全培養基(jī)

培養基
： 兔心肌成(chéng)纖(xiān)維(wéi)細胞完(wán)全(quán)培養(yǎng)基(基礎培(péi)養(yǎng)基(jī)，含FBS，bFGF，Insulin，Penicillin，Streptomycin等)

換(huàn)液頻率(shuài)
： 每(měi)2-3天(tiān)換(huàn)液一次(cì)

生長特性
： 貼(tiē)壁(bì)

細胞(bāo)形(xíng)態(tài)
： 成(chéng)纖維細(xì)胞樣

傳(chuán)代(dài)比例(lì)
： 1:2

傳(chuán)代特性
： 可傳(chuán)5代左(zuǒ)右；3代(dài)以內狀(zhuàng)態最佳(jiā)

消化(huà)液
： 0.25%胰蛋(dàn)白(bái)酶

兔(tù)心(xīn)肌(jī)成(chéng)纖(xiān)維細胞體外(wài)培養周期(qī)有(yǒu)限；建(jiàn)議使(shǐ)用配套(tào)的專用生(shēng)長(cháng)培養(yǎng)基及(jí)正(zhèng)確(què)的操(cāo)作方法來(lái)培(péi)養，以此保證(zhèng)該細胞(bāo)的最佳(jiā)培養狀態(tài)。

方法簡(jiǎn)介 實驗室(shì)分離的兔心(xīn)肌(jī)成纖(xiān)維(wéi)細胞采(cǎi)用(yòng)膠(jiāo)原酶-胰(yí)蛋白(bái)酶聯合(hé)消化結(jié)合(hé)差(chà)速(sù)貼壁(bì)法製(zhì)備而(ér)來，細胞(bāo)總量(liáng)約為5×10⁵ cells/瓶。

質量檢測 實(shí)驗(yàn)室分(fēn)離(lí)的兔心肌成(chéng)纖維(wéi)細胞(bāo)經(jīng)Vimentin/α-SMA免疫(yì)熒(yíng)光鑒定(dìng)，純度可達90%以(yǐ)上(shàng)，且不含有HIV-1，HBV，HCV，支原體，細菌(jūn)，酵(jiào)母(mǔ)和(hé)真菌(jūn)等(děng)。