牛(niú)冠狀病毒(dú)（Bovine Coronavirus
，BCoV）屬於冠狀(zhuàng)病毒科
，冠(guān)狀(zhuàng)病毒(dú)屬
2a 亞群(qún)
，是(shì)引起新(xīn)生犢牛腹瀉(xiè)，成(chéng)年牛(niú)冬(dōng)痢和(hé)呼吸道感染的(dí)重(zhòng)要(yào)病原(yuán)。流(liú)行(háng)病學
調查表明(míng)
，牛(niú)冠狀病(bìng)毒在(zài)牛(niú)場(cháng)中普遍存(cún)在(zài)
，主(zhǔ)要(yào)通過消化道(dào)和呼吸道(dào)傳播(bō)
，感(gǎn)染
的(dí)牛長(cháng)期(qī)帶(dài)毒並在一(yī)定時期(qī)內(nèi)持(chí)續排(pái)毒
，易(yì)造(zào)成牛(niú)群的大範圍感染。因此
，對帶
毒(dú)牛的(dí)及時檢出和牛場環境(jìng)監測就顯得尤為重(zhòng)要。本(běn)產(chǎn)品就是專門(mén)用於(yú)牛冠(guān)狀病
毒的快速熒(yíng)光 RT-PCR 檢測的試劑盒(hé)
，在毒(dú)牛(niú)或牛(niú)場環境的檢(jiǎn)測領(lǐng)域有(yǒu)廣泛用
途(tú)
，它具有下列(liè)特點：
1. 即(jí)開(kāi)即(jí)用
，用戶(hù)隻(zhī)需要提(tí)供病(bìng)毒 RNA 模板(bǎn)。
2. 使用(yòng) RNase H 已(yǐ)經突變的(dí) SuperMMLV 逆(nì)轉錄(lù)酶
，減(jiǎn)少了(liǎo) RT 過(guò)程中(zhōng) RNA
的降(jiàng)解。
3. 使用(yòng)熱(rè)啟(qǐ)動的 Taq DNA 聚合(hé)酶(méi)
，降(jiàng)低了非特(tè)異(yì)性(xìng)擴增。
4. 熒(yíng)光定量檢測
，所(suǒ)含 SYBR Green I 隻與雙(shuāng)鏈 DNA 結合
，反(fǎn)應(yīng)特(tè)異(yì)性強(qiáng)。適(shì)
用於(yú)不需(xū)要 ROX 做校正(zhèng)染(rǎn)料(liào)的熒光 PCR 儀。
5. 產(chǎn)品的有效綫(xiàn)性範圍廣
，定(dìng)量更加準(zhǔn)確(què)。
6. 引(yǐn)物經過(guò)優化
，特異性高(gāo)
，不(bù)會誤檢牛輪(lún)狀(zhuàng)病毒（BRV），牛病毒(dú)性(xìng)腹瀉病毒
（BVDV）和牛(niú)流行(háng)熱病毒（BEFV）等(děng)常見(jiàn)牛類病毒。
7. 引物(wù)是(shì)根(gēn)據保(bǎo)守的(dí) N 基(jī)因(yīn)設(shè)計
，產物(wù)長度為 100 bp。

運輸(shū)及(jí)保存(cún):

使用(yòng)方(fāng)法(fǎ):

一，樣(yàng)品(pǐn) RNA 的(dí)製備(bèi) 
用自選(xuǎn)方法(fǎ)純化(huà) BCoV 樣(yàng)品的(dí) RNA
，也可(kě)以(yǐ)另購本公(gōng)司的(dí)一管(guǎn)式(shì)病(bìng)毒(dú)
RNAout 或(huò)柱式病(bìng)毒 RNAout
，上(shàng)述兩款產品(pǐn)跟本(běn)試劑盒兼容。
二，RT（逆(nì)轉(zhuǎn)錄(lù)）反應(yīng)合成(chéng) cDNA
按照(zhào)下表配(pèi)製(zhì) RT 反應體係(xì)（20 uL 體係）：
成份(fèn) 用量
RNA 模板(bǎn)（自備） 由於一(yī)般(bān)不知(zhī)病毒RNA濃度,用(yòng)1-10 uL即(jí)可
BCoV 專(zhuān)一性(xìng)引物(wù)二 2 uL
RNase-free 水 補水到(dào) 13 uL
70℃保(bǎo)溫(wēn) 5 min 變性模板後(hòu)立即冰浴。
RT Buffer(含(hán) dNTP) 5 uL
37℃保(bǎo)溫(wēn) 5 min。
SuperMMLV 逆(nì)轉錄(lù)酶 2 uL
42℃保溫 60 min。此步為 RT 反應(yīng)。
70℃保溫(wēn) 10 min 以終(zhōng)止(zhǐ)反(fǎn)應(yīng)
，然(rán)後放置在(zài)冰上(shàng)待用。合成(chéng)的 cDNA 可(kě)以(yǐ)
直(zhí)接作為(wéi) PCR 模板(bǎn)使用
，不(bù)需要純化。
三，設置(zhì)熒光 PCR 反(fǎn)應(yīng)（50 uL 體(tǐ)係）
1. 配製 8-10 個(gè)濃(nóng)度範圍(wéi)的標準(zhǔn)品(pǐn)：用 DNA 稀(xī)釋液將(jiāng) BCoV 標準品(pǐn)稀(xī)釋成 8-10
個濃度
，待用。
2. 在 PCR 管中(zhōng)加入下(xià)列(liè)成分(fēn)（N 跟據稀釋度由客戶自己決定(dìng)）：
成 份(fèn) 樣品(pǐn)
標準品
（8-10 管(guǎn)）
陰(yīn)性對照
2×qPCR Mix 25 uL 25 uL 25 uL
cDNA 樣品（上(shàng)步的(dí) RT 反應液） 1-5 uL 無(wú) 無
標準(zhǔn)品(pǐn)(8-10 個(gè)濃(nóng)度) 無(wú) N uL 每管(guǎn) 無(wú)
BCoV 專一性(xìng)引(yǐn)物一(yī) 2 uL 2 uL 2 uL
BCoV 專一(yī)性引(yǐn)物(wù)二 2 uL 2 uL 2 uL
補(bǔ)水到 50 uL
3. 上(shàng)機進(jìn)行 PCR。熒光(guāng)定量(liáng) PCR 反應(yīng)參數為(wéi)（以(yǐ) ABI7500 熒光定(dìng)量 PCR 儀(yí)
為參考(kǎo)）:
過程 溫度 時(shí)間(jiān)
預變性（此(cǐ)步(bù)用於(yú)活化熱啟動 Taq 聚(jù)合(hé)酶(méi)） 95℃ 30 s
PCR 反應(yīng)
（35-40 個(gè)循環）
95℃ 5 s
60℃ 30 s
72℃ 10 min
熔解曲綫(xiàn)分(fēn)析
95℃ 5 s
65℃ 1 min
95℃ 15 s
50℃ 30 s
4. 根據(jù) 8-10 個標準品的(dí) Ct 值（X 軸）和濃度(dù)（X 軸）描(miáo)出標(biāo)準(zhǔn)曲(qū)綫
，用(yòng)待(dài)測
樣品 Ct 值推(tuī)出其濃(nóng)度。