植(zhí)物維(wéi)生素D3(VD3)試劑(jì)盒酶(méi)聯(lián)免(miǎn)疫分析（ELISA）試(shì)劑(jì)盒(hé)操作(zuò)步驟

1.        標準(zhǔn)品(pǐn)的稀釋與加樣：在酶(méi)標(biāo)包被板上(shàng)設(shè)標(biāo)準品(pǐn)孔10孔(kǒng)
，在第(dì)一
，第(dì)二(èr)孔(kǒng)中分(fēn)別加(jiā)標準品100μl
，然(rán)後在第一
，第二(èr)孔中(zhōng)加標準(zhǔn)品稀(xī)釋液50μl
，混(hùn)匀(yún)；然(rán)後從第(dì)一孔(kǒng)
，第二孔中(zhōng)各取(qǔ)100μl分別加到第三(sān)孔(kǒng)和第四孔
，再在第(dì)三(sān)
，第(dì)四(sì)孔分別(bié)加標(biāo)準品稀釋液(yè)50μl
，混(hùn)匀；然(rán)後(hòu)在(zài)第三孔和第四孔(kǒng)中先各取50μl棄(qì)掉
，再(zài)各(gè)取50μl分(fēn)別加到(dào)第五
，第六孔中
，再在第(dì)五(wǔ)
，第(dì)六(liù)孔中分別加(jiā)標準(zhǔn)品稀釋(shì)液50ul
，混匀(yún)；混(hùn)匀後從(cóng)第五
，第(dì)六孔中各(gè)取50μl分別加(jiā)到第(dì)七
，第八孔中
，再在第(dì)七(qī)
，第八孔(kǒng)中分別加(jiā)標(biāo)準品(pǐn)稀(xī)釋液(yè)50μl
，混匀後(hòu)從第(dì)七
，第(dì)八孔中(zhōng)分(fēn)別取(qǔ)50μl加到第九
，第十孔中
，再在(zài)第九(jiǔ)第十(shí)孔分(fēn)別加(jiā)標準品稀(xī)釋液50μl
，混(hùn)匀(yún)後從(cóng)第九第十孔中各(gè)取(qǔ)50μl棄(qì)掉(diào)。（稀(xī)釋(shì)後各孔加樣(yàng)量都(dū)為50μl
，濃(nóng)度(dù)分(fēn)別為1800ng/L
，1200ng/L
，600ng/L
，300ng/L
， 150ng/L）。

2.         加樣(yàng)：分別(bié)設(shè)空白孔(kǒng)（空白(bái)對(duì)照(zhào)孔(kǒng)不加樣(yàng)品(pǐn)及酶(méi)標試劑(jì)
，其餘各(gè)步操作(zuò)相同）
，待(dài)測(cè)樣品孔。在酶標包(bāo)被(bèi)板(bǎn)上待測(cè)樣品(pǐn)孔中(zhōng)先加(jiā)樣品稀(xī)釋液(yè)40μl
，然後再加待(dài)測(cè)樣品10μl（樣(yàng)品(pǐn)最(zuì)終(zhōng)稀釋度為5倍）。加樣將(jiāng)樣(yàng)品加(jiā)於酶標板孔底部
，盡(jìn)量不(bù)觸(chù)及(jí)孔(kǒng)壁
，輕(qīng)輕(qīng)晃動(dòng)混匀。

3.         溫(wēn)育：用(yòng)封(fēng)板(bǎn)膜封(fēng)板後置37℃溫育30分(fēn)鐘(zhōng)。

4.         配液：將(jiāng)30（48T的(dí)20倍）倍(bèi)濃(nóng)縮洗滌液(yè)用(yòng)蒸(zhēng)餾水(shuǐ)30（48T的20倍(bèi)）倍(bèi)稀釋後備用。

5.         洗滌(dí)：小心(xīn)揭掉(diào)封板膜
，棄去液體(tǐ)
，甩(shuǎi)幹
，每(měi)孔(kǒng)加(jiā)滿(mǎn)洗(xǐ)滌(dí)液(yè)
，靜(jìng)置(zhì)30秒後(hòu)棄(qì)去
，如此重(zhòng)復(fù)5次(cì)
，拍(pāi)幹(gān)。

6.         加(jiā)酶(méi)：每(měi)孔加入酶(méi)標(biāo)試劑50μl
，空白(bái)孔除外(wài)。

7.         溫(wēn)育(yù)：操(cāo)作(zuò)同3。

8.         洗滌：操(cāo)作同5。

9.         顯(xiǎn)色：每(měi)孔先加(jiā)入顯色劑A50μl
，再(zài)加(jiā)入顯(xiǎn)色劑(jì)B50μl
，輕輕震蕩(dàng)混匀
，37℃避(bì)光顯色15分(fēn)鐘(zhōng).

10.     終止(zhǐ)：每孔(kǒng)加(jiā)終止液50μl
，終止反應（此時(shí)藍(lán)色(sè)立(lì)轉黃(huáng)色(sè)）。

11.     測定：以(yǐ)空白空調零(líng)
，450nm波(bō)長(cháng)依序(xù)測(cè)量各(gè)孔(kǒng)的吸(xī)光度（OD值(zhí)）。 測(cè)定應(yīng)在(zài)加終(zhōng)止液後(hòu)15分鐘以(yǐ)內進行(háng)。