猴(hóu)子(zǐ)α1微球蛋(dàn)白（α1-MG）elisa試(shì)劑盒(hé)說(shuō)明(míng)書(shū)

elisa試(shì)劑盒(hé)常見組成(chéng)部分：

1）酶和底物：在ELISA中zui常(cháng)用的(dí)酶(méi)為(wéi)HRP和ALP。

2）抗體(tǐ)：在(zài)ELISA中應(yīng)用的(dí)抗體可(kě)分為(wéi)多克隆抗(kàng)體(tǐ)(多抗)和(hé)單(dān)克隆抗體(tǐ)(單(dān)抗)。

3）抗(kàng)原：在(zài)ELISA中應用(yòng)的(dí)抗原要求有(yǒu)較(jiào)高的特異性，親(qīn)和(hé)力(lì)和純度(dù)。主要有三類，即自(zì)然抗原，人工合(hé)成(chéng)抗原和(hé)基(jī)因重(zhòng)組(zǔ)抗原(yuán)。

4 人(rén)E選擇素(E-Selectin/CD62E)檢(jiǎn)測試(shì)劑(jì)盒(hé)包(bāo)被(bèi)：將免(miǎn)疫活性物質(抗(kàng)原或(huò)抗體(tǐ))結(jié)合於固相載體(tǐ)上(shàng)的過(guò)程(chéng)稱(chēng)為包(bāo)被。常(cháng)用的材料(liào)有聚苯乙(yǐ)烯，硝(xiāo)酸(suān)纖(xiān)維薄(báo)膜等；常(cháng)用的方法(fǎ)有(yǒu)吸附法，化學交聯法及親(qīn)和素-生(shēng)物(wù)素間(jiān)接(jiē)包被法

5）固(gù)相載(zǎi)體：固相(xiāng)載體是ELISA中(zhōng)用以分離結合標記物(wù)和遊(yóu)離標(biāo)記物的(dí)主要手段(duàn)，應與(yǔ)各種(zhǒng)免(miǎn)疫(yì)活(huó)性物質有良好的(dí)結合性能並(bìng)且(qiě)不(bù)改(gǎi)變其免(miǎn)疫(yì)活(huó)性。常用的固相載(zǎi)體(tǐ)有(yǒu)聚苯乙烯塑(sù)料(liào)和硝酸(suān)纖維素膜(mó)。

樣本實驗前(qián)準(zhǔn)備：

ELISA試劑(jì)盒液體樣(yàng)本：包(bāo)括血(xiě)清(qīng)，血(xiě)漿，尿液(yè)，胸(xiōng)腹水，腦脊液，細(xì)胞(bāo)培養上清等(děng)。

（1）血清

室(shì)溫(wēn)血液(yè)自(zì)然(rán)凝固10-20分鐘後，離(lí)心20分鐘(zhōng)左(zuǒ)右(yòu)（2000-3000轉(zhuǎn)/分(fēn)）。仔細收(shōu)集(jí)上(shàng)清。保存過程中如(rú)有(yǒu)沉澱形成(chéng)，應(yīng)再次(cì)離心。

（2）血漿：

應根(gēn)據(jù)標本的(dí)要求(qiú)選擇EDTA，檸檬酸(suān)鈉或肝素作(zuò)為(wéi)抗凝劑，混合10-20分鐘後，離心(xīn)20分鐘(zhōng)左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集(jí)上(shàng)清。保(bǎo)存(cún)過程(chéng)中(zhōng)如有沉澱形成，應再(zài)次(cì)離心。

（3）尿(niào)液(yè)：

用無(wú)菌管收集(jí)。離心(xīn)20分鐘(zhōng)左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分(fēn)）。仔細(xì)收集(jí)上(shàng)清。保存(cún)過(guò)程中(zhōng)如有(yǒu)沉澱(diàn)形(xíng)成(chéng)，應(yīng)再(zài)次離心。胸腹水(shuǐ)，腦(nǎo)脊液(yè)參照(zhào)此(cǐ)實(shí)行(háng)。

（4）細胞(bāo)培(péi)養上(shàng)清：

檢(jiǎn)測(cè)分泌(mì)性(xìng)的成(chéng)份(fèn)時(shí)，用無(wú)菌(jūn)管(guǎn)收集。離(lí)心(xīn)20分鐘左右(yòu)（2000-3000轉/分）。仔細(xì)收集上清。

（5）培養(yǎng)細胞

檢測細(xì)胞內的成(chéng)份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀(xī)釋(shì)細(xì)胞(bāo)懸液，細胞濃度達到100萬/ml左(zuǒ)右。通過反復(fù)凍融或加(jiā)入組(zǔ)織蛋白萃(cuì)取試劑(jì)，以(yǐ)使細胞(bāo)破壞並(bìng)放(fàng)出(chū)細(xì)胞內成份。離心20分鐘左右(yòu)（2000-3000轉/分）。仔(zī)細收(shōu)集上清(qīng)。保(bǎo)存(cún)過(guò)程中(zhōng)如(rú)有(yǒu)沉澱形(xíng)成(chéng)，應(yīng)再次(cì)離(lí)心。

（6）組織標本(běn)

切(qiē)割(gē)標本(běn)後(hòu)，稱(chēng)取重(zhòng)量。加(jiā)入(rù)一(yī)定(dìng)量的PBS，PH7.4。用液(yè)氮(dàn)迅速冷(lěng)凍保存備(bèi)用。標本(běn)融化(huà)後仍(réng)然(rán)保持(chí)2-8℃的(dí)溫(wēn)度。加入(rù)一(yī)定量的(dí)PBS（PH7.4），或組織(zhī)蛋(dàn)白(bái)萃(cuì)取試劑(jì), 用手工(gōng)或匀(yún)漿(jiāng)器將標本匀(yún)漿化(huà)。離(lí)心20分(fēn)鐘(zhōng)左右(yòu)（2000-3000轉/分）。仔細收(shōu)集上清。分(fēn)裝(zhuāng)後一(yī)份(fèn)待檢(jiǎn)測，其(qí)餘(yú)冷凍備用(yòng)。

操作(zuò)步驟

1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標包(bāo)被(bèi)板(bǎn)上設標準品(pǐn)孔(kǒng)10孔(kǒng)，在di一(yī)，第二孔中分別(bié)加標(biāo)準(zhǔn)品100μl，然後在(zài)di一(yī)，第二(èr)孔(kǒng)中加標準品(pǐn)稀釋液50μl，混(hùn)匀；然(rán)後(hòu)從(cóng)di一孔，第二(èr)孔中(zhōng)各取100μl分(fēn)別(bié)加到(dào)第三(sān)孔(kǒng)和第四孔，再(zài)在第三(sān)，第(dì)四(sì)孔(kǒng)分(fēn)別加標準品(pǐn)稀釋液(yè)50μl，混(hùn)匀(yún)；然(rán)後在第(dì)三(sān)孔和第四孔中(zhōng)先各取50μl棄掉，再各(gè)取(qǔ)50μl分別取50μl分別加(jiā)到(dào)第(dì)七(qī)，第(dì)八孔(kǒng)中，再在第(dì)七(qī)，第(dì)八(bā)孔中分別加(jiā)標(biāo)準品(pǐn)稀(xī)釋液(yè)50μl，混匀後(hòu)從(cóng)第七，第(dì)八孔中加到(dào)第五，第(dì)六(liù)孔中(zhōng)，再在第(dì)五(wǔ)，第(dì)六(liù)孔(kǒng)中分別(bié)加(jiā)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋(shì)液(yè)50ul，混(hùn)匀(yún)；混匀(yún)後從第五，第六(liù)孔中(zhōng)各(gè)分別取50μl加(jiā)到第九，第(dì)十孔(kǒng)中，再在(zài)第(dì)九(jiǔ)第十(shí)孔(kǒng)分(fēn)別(bié)加(jiā)標(biāo)準品(pǐn)稀釋液50μl，混(hùn)匀後從(cóng)第(dì)九(jiǔ)第(dì)十孔(kǒng)中各取50μl棄(qì)掉。（稀釋後(hòu)各(gè)孔加樣量(liáng)都(dū)為(wéi)50μl，濃度(dù)分(fēn)別為180 ng/L，120 ng/L ，60 ng/L，30 ng/，15 ng/L）。

2. 加樣(yàng)：分別設空(kōng)白(bái)孔（空白對照孔(kǒng)不加樣品(pǐn)及酶(méi)標(biāo)試劑，其(qí)餘(yú)各步操作相(xiāng)同(tóng)），待測樣(yàng)品孔。在(zài)酶標(biāo)包(bāo)被板上待測(cè)樣品(pǐn)孔(kǒng)中先加樣(yàng)品(pǐn)稀釋液40μl，然(rán)後(hòu)再(zài)加待測(cè)樣品10μl（樣品最(zuì)終稀(xī)釋(shì)度為5倍(bèi)）。加(jiā)樣(yàng)將(jiāng)樣品加於(yú)酶標板(bǎn)孔底部(bù)，盡量不觸(chù)及(jí)孔(kǒng)壁，輕輕晃(huǎng)動混匀。

3. 溫育(yù)：用(yòng)封板(bǎn)膜(mó)封板後(hòu)置37℃溫(wēn)育(yù)30分(fēn)鐘。

4. 配液：將30（48T的(dí)20倍）倍(bèi)濃(nóng)縮洗(xǐ)滌(dí)液用(yòng)蒸(zhēng)餾水(shuǐ)30（48T的(dí)20倍(bèi)）倍(bèi)稀釋後(hòu)備用。

5. 洗(xǐ)滌：小(xiǎo)心揭(jiē)掉封板膜，棄去液體，甩(shuǎi)幹，每孔(kǒng)加(jiā)滿(mǎn)洗滌(dí)液，靜置30秒後棄去(qù)，如(rú)此(cǐ)重(zhòng)復5次，拍(pāi)幹(gān)。

6. 加酶：每(měi)孔(kǒng)加(jiā)入(rù)酶標(biāo)試(shì)劑(jì)50μl，空白(bái)孔除外(wài)。

7. 溫育：操作同3。

8. 洗滌：操作(zuò)同(tóng)5。

9. 顯色(sè)：每孔(kǒng)先加入(rù)顯色(sè)劑A50μl，再加入(rù)顯色(sè)劑(jì)B50μl，輕(qīng)輕震(zhèn)蕩混匀，37℃避(bì)光顯色(sè)15分鐘.

10. 終(zhōng)止(zhǐ)：每(měi)孔(kǒng)加終止(zhǐ)液50μl，終(zhōng)止反(fǎn)應（此(cǐ)時藍色(sè)立(lì)轉(zhuǎn)黃(huáng)色）。

11. 測定：以(yǐ)空(kōng)白空調(tiáo)零(líng)，450nm波長依(yī)序測量各孔的吸光(guāng)度（OD值(zhí)）。 測定(dìng)應在加(jiā)終(zhōng)止(zhǐ)液(yè)後15分鐘(zhōng)。

注(zhù)意事項

1. 試劑(jì)盒從冷藏環境中(zhōng)取出應(yīng)在(zài)室(shì)溫平(píng)衡(héng)15-30 分(fēn)鐘(zhōng)後方可(kě)使(shǐ)用，酶(méi)標包被板開(kāi)封後(hòu)如(rú)未用完(wán)，板(bǎn)條應裝(zhuāng)入(rù)密(mì)封(fēng)袋(dài)中(zhōng)保存(cún)。

2. 濃(nóng)洗(xǐ)滌(dí)液(yè)可能(néng)會(huì)有結(jié)晶析(xī)出(chū)，稀釋(shì)時(shí)可在水浴(yù)中加溫助(zhù)溶，洗(xǐ)滌時(shí)不影(yǐng)響結(jié)果(guǒ)。

3. 各(gè)步(bù)加(jiā)樣均(jūn)應使用加樣器，並經常校對其(qí)準(zhǔn)確性(xìng)，以(yǐ)避免(miǎn)試驗(yàn)誤(wù)差。一(yī)次加樣時(shí)間好控製(zhì)在5 分鐘(zhōng)內，如(rú)標本數量(liáng)多，推(tuī)薦使(shǐ)用排槍(qiāng)加(jiā)樣(yàng)。

4. 封板膜(mó)隻限(xiàn)一次(cì)性使用(yòng)，以(yǐ)避免交(jiāo)叉汙染。

5. 底物請(qǐng)避光保(bǎo)存。

6. 嚴格按(àn)照說(shuō)明(míng)書的(dí)操(cāo)作(zuò)進(jìn)行，試驗結果判(pàn)定必須以酶(méi)標儀(yí)讀數為準(zhǔn).

7. 所有樣品(pǐn)，洗滌液和各種廢棄(qì)物都應按(àn)傳染物處理。

8. 本試(shì)劑不同(tóng)批號組分(fēn)不得混用(yòng)。

9.如需(xū)代測或(huò)者(zhě)樣本暫時不測定(dìng)，可立即低溫凍(dòng)存(cún)，溫(wēn)度(dù)越低(dī)越(yuè)好(hǎo)，中間(jiān)避免反(fǎn)復凍(dòng)融，-20℃以下(xià)可保存(cún)三(sān)個月(yuè),-70℃以下(xià)可(kě)保存(cún)六個月。

10.試劑使用須知：

11.（1）請參照(zhào)相關(guān)法規(guī)，文(wén)獻(xiàn)，MSDS等信(xìn)息，理解並掌握好試劑(jì)的特(tè)性(xìng)，再(zài)進行(háng)安全操作。

12.（2）通常(cháng)購(gòu)買試劑時一(yī)定要想到一(yī)次性用(yòng)完。若(ruò)估(gū)算不(bù)足(zú)有剩(shèng)餘的(dí)話(huà)，更(gēng)加(jiā)注意(yì)其(qí)他(tā)保管(guǎn)和管理。

13.（3）萬(wàn)一(yī)試劑操作(zuò)者(zhě)並(bìng)非專業技(jì)術(shù)人員。必須在(zài)專業人(rén)士的指導監(jiān)督下(xià)進(jìn)行操(cāo)作(zuò)。對於使(shǐ)用(yòng)後的(dí)廢棄物，不要(yào)或(huò)者舊的試劑，應按(àn)照相關法律法規正當處理。

14.（4）購(gòu)買(mǎi)後，請務必(bì)確認標(biāo)簽(qiān)上的(dí)注意事項(xiàng)；做(zuò)好(hǎo)預(yù)防顛倒(dǎo)，摔壞(huài)的(dí)措(cuò)施和管理體(tǐ)製；在使用前再(zài)次(cì)確(què)認標簽(qiān)上(shàng)的(dí)注(zhù)意(yì)事(shì)項(xiàng)，做(zuò)好(hǎo)必要的安全對策(cè)；對(duì)沒有(yǒu)標(biāo)明其危(wēi)害特(tè)性(xìng)，有害(hài)特(tè)性的(dí)，也(yě)要慎重(zhòng)地進行(háng)操作；必須(xū)帶好防(fáng)護用具，小(xiǎo)心翼翼(yì)進行操作。