人膀胱癌(ái)順鉑耐藥株BIU-87/DDP注意事項

一(yī)，燒瓶培養的(dí)處理程(chéng)序

在培養瓶中接(jiē)種(zhǒng)細胞並在(zài)培(péi)養(yǎng)基中(zhōng)完全填(tián)充培(péi)養(yǎng)基以防止(zhǐ)運輸過(guò)程中(zhōng)細(xì)胞的丟失(shī)。

1，收到(dào)後(hòu)，目視檢(jiǎn)查(chá)培養物是否(fǒu)有微生(shēng)物(wù)汙染(rǎn)的(dí)宏(hóng)觀(guān)證據(jù)。

使用(yòng)倒置顯微鏡(jìng)（配備(bèi)有(yǒu)相位(wèi)傳(chuán)感器），仔細(xì)檢查是否有(yǒu)微生(shēng)物汙(wū)染(rǎn)的證(zhèng)據。還檢查(chá)以確定(dìng)大(dà)多數細(xì)胞(bāo)是否(fǒu)仍(réng)然附(fù)著在燒(shāo)瓶底(dǐ)部？在運輸過(guò)程(chéng)中，培(péi)養物(wù)有(yǒu)時被(bèi)粗(cū)略地(dì)處(chǔ)理，並且(qiě)許多(duō)細胞(bāo)經常分離(lí)並(bìng)懸浮在培養基(jī)中(zhōng)（但仍(réng)然是可行的(dí)）。

2，如果(guǒ)細胞仍(réng)然附(fù)著(zhuó)，無(wú)菌(jūn)去除5至(zhì)10毫升的運(yùn)輸(shū)介質。可(kě)以節省運(yùn)輸媒介(jiè)以(yǐ)重復使(shǐ)用。在(zài)5%℃的(dí)空氣中，在(zài)37℃下培(péi)養細胞，直(zhí)到(dào)它(tā)們準(zhǔn)備(bèi)進行(háng)傳(chuán)代(dài)培(péi)養。

3.如(rú)果細(xì)胞沒有(yǒu)附(fù)著(zhuó)，無(wú)菌地(dì)移(yí)除(chú)燒瓶的(dí)全(quán)部(bù)內容物，並以1000rpm離心5至10分鐘(zhōng)。取出運(yùn)輸介(jiè)質(zhì)並保(bǎo)存。在10毫(háo)升這(zhè)種培(péi)養基中重新(xīn)沉(chén)澱顆(kē)粒(lì)細(xì)胞並加入(rù)25厘米的(dí)燒瓶中。在(zài)空氣中(zhōng)5%℃下，在37℃下孵(fū)育，直(zhí)至細(xì)胞(bāo)準備進(jìn)行傳(chuán)代培(péi)養。

二，傳代(dài)程序

體(tǐ)積(jī)為75厘米的(dí)燒(shāo)瓶。增(zēng)加或減(jiǎn)少其(qí)他尺寸(cùn)培養容器(qì)所需的分離(lí)培養基的量(liáng)。

1，去(qù)除和丟棄培(péi)養基(jī)。

2.用(yòng)0.25%(w/v)胰蛋白酶(méi)0.53mM EDTA溶液(yè)衝(chōng)洗細(xì)胞層(céng)，除(chú)去(qù)所有含(hán)有胰蛋白(bái)酶(méi)抑(yì)製劑的血(xiě)清痕跡。

3.添(tiān)加(jiā)2.0~3.0 ml胰(yí)酶(méi)-EDTA溶(róng)液(yè)瓶中(zhōng)，倒置顯(xiǎn)微鏡下觀察(chá)細(xì)胞到細(xì)胞層分散(sàn)（取決(jué)於胰(yí)蛋(dàn)白酶的批）。

注意(yì)：為了(liǎo)避(bì)免(miǎn)結(jié)塊，不(bù)要在擊(jī)打(dǎ)或(huò)搖晃(huǎng)瓶子(zǐ)時攪(jiǎo)拌細胞，等待細(xì)胞分離(lí)。難以(yǐ)分離的細胞可以(yǐ)放置在37°C以(yǐ)促進擴散(sàn)。

4，加入6～8毫(háo)升的(dí)完(wán)整(zhěng)生長(cháng)培(péi)養(yǎng)基，輕輕(qīng)吸液(yè)，抽(chōu)吸細胞。

5，在新培(péi)養(yǎng)容(róng)器中加(jiā)入適當的(dí)細胞(bāo)懸液(yè)等(děng)分試(shì)樣。

6，培(péi)養(yǎng)37°C培養(yǎng)基(jī)。

推薦栽培(péi)比(bǐ)為1:3∶1:4。

介(jiè)質(zhì)更(gēng)新：每周2至3次(cì)

三，冷凍(dòng)保存(cún)程序(xù)

該協(xié)議使(shǐ)用量(liáng)在75平方(fāng)厘(lí)米的瓶
；比(bǐ)例減少或增加的其(qí)他(tā)尺(chǐ)寸的分離(lí)介(jiè)質的培養(yǎng)容器的數量(liáng)。

1，去(qù)除和丟棄培養(yǎng)基。

2。簡(jiǎn)要(yào)衝洗細胞(bāo)層(céng)0.25（w/v）trypsin0.53mm EDTA溶液去除(chú)所有(yǒu)痕(hén)跡(jì)血清含有(yǒu)胰蛋(dàn)白酶抑(yì)製(zhì)劑。

3。加入(rù)2至3毫升(shēng)的(dí)胰蛋白(bái)酶-EDTA溶(róng)液瓶(píng)中(zhōng)，倒置顯(xiǎn)微鏡下(xià)觀察(chá)細(xì)胞到細胞(bāo)層是分(fēn)散的(dí)（通常在1到10分鐘(zhōng)）。

注意：為了避免結(jié)塊(kuài)，不(bù)要在擊(jī)打或搖(yáo)晃瓶子(zǐ)時攪拌細(xì)胞(bāo)，等(děng)待(dài)細胞分(fēn)離(lí)。難以分離的細胞(bāo)可(kě)以(yǐ)放置(zhì)在37°C以促(cù)進(jìn)擴散。

4，加入(rù)6～8毫升的完整(zhěng)生(shēng)長培(péi)養(yǎng)基(jī)，輕(qīng)輕(qīng)吸液(yè)，抽吸細胞。

5。去(qù)除(chú)胰酶EDTA溶液，將(jiāng)細胞懸(xuán)液到離(lí)心管和(hé)旋轉(zhuǎn)約(yuē)5 1000rpmfor 10分鐘(zhōng)。

6，低溫保存培養液中的上清液(yè)和復蘇細(xì)胞(bāo)。

7，將細(xì)胞轉移至(zhì)低溫(wēn)瓶(píng)，1ml／瓶。

8，低溫容器中的(dí)細(xì)胞(bāo)Frozen（NalgENα5100-01）。