產品特(tè)征(zhēng):
 
靈敏(mǐn)度(dù)高(gāo)：能(néng)對(duì)低(dī)拷貝(bèi)或多(duō)樣性模(mó)板進(jìn)行定量(liáng)。
特異性強：采用熱(rè)啟(qǐ)動酶(méi)的激活機(jī)製，抑(yì)製非(fēi)特(tè)異性(xìng)擴(kuò)增 。
重復性好：擴增曲綫重(zhòng)合度(dù)高(gāo)，受(shòu)幹(gān)擾影(yǐng)響少。
擴(kuò)增效率高(gāo)：擴(kuò)增(zēng)曲(qū)綫(xiàn)Ct值(zhí)低(dī)，起峰快(kuài)，效率高。
原理(lǐ):
所謂(wèi)實(shí)時(shí)熒(yíng)光(guāng)定量PCR技(jì)術(shù)，是指(zhǐ)在PCR反應體係中加入熒光基團，利用熒(yíng)光(guāng)信號(hào)積(jī)累實時監測整個PCR進(jìn)程，後通過標(biāo)準曲(qū)綫對未(wèi)知模(mó)板進行(háng)定(dìng)量(liáng)分析(xī)的方法。
需(xū)要(yào)自備(bèi)的器材(cái)：
1．儀(yí)器：分(fēn)析(xī)天平
，離心機(jī)
，熒光(guāng) PCR 擴(kuò)增儀
，組(zǔ)織研磨(mó)器(qì)
，-20 ℃冰箱
，可(kě)調移液器（2 µL
，20µL
，200 µL
，1000 µL）。
2．耗(hào)材：熒光 PCR 反(fǎn)應管
，眼(yǎn)科剪
，眼(yǎn)科(kē)鑷
，生(shēng)理(lǐ)鹽水
，1.5 mL 經焦碳酸二(èr)乙(yǐ)酯（DEPC）水
處理的滅(miè)菌離心管(guǎn)
，吸(xī)頭（10 µL
，200 µL
，1000 µL）
，滅菌雙(shuāng)蒸水。
具(jù)有下列特(tè)點：
1.產品(pǐn)僅(jǐn)用於科(kē)研(yán)即開即(jí)用，用戶隻需(xū)要(yào)提(tí)供樣品 DNA 模板(bǎn)，操作簡單(dān)，定(dìng)量(liáng)準確(què)快(kuài)速。
2. 引(yǐn)物經(jīng)過優(yōu)化，特(tè)異(yì)性(xìng)強。預期(qī)的 PCR 產(chǎn)物長(cháng)度(dù)為 560 bp。
3. PCR mix 中含上(shàng)樣(yàng)染料，PCR 後(hòu)可(kě)以直(zhí)接上(shàng)樣電(diàn)泳。
4. 提供陽性對照，便於分(fēn)析試(shì)驗結果。
檢測(cè)方法(fǎ)：
1.Ⅰ法(fǎ)：
在PCR反(fǎn)應體(tǐ)係(xì)中，加(jiā)入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特(tè)異性地摻入(rù)DNA雙鏈後，發(fā)射熒光信(xìn)號(hào)，而不摻(chān)入(rù)鏈(liàn)中的(dí)SYBR染(rǎn)料分子不會發射任(rèn)何熒光信號(hào)，從(cóng)而保(bǎo)證熒(yíng)光信號的(dí)增加與PCR產物的增(zēng)加(jiā)wan全同步(bù)。
定(dìng)量PCR擴增熒(yíng)光(guāng)曲綫(xiàn)圖
PCR產物熔(róng)解(jiě)曲綫(xiàn)圖(tú)
2.TaqMan探(tàn)針法：
探針完整(zhěng)時(shí)，報告基團發(fā)射的(dí)熒(yíng)光信(xìn)號(hào)被(bèi)淬(cuì)滅(miè)基團吸收；PCR擴(kuò)增時，Taq酶(méi)的(dí)5’-3’外切酶活性將探針(zhēn)酶切(qiē)降(jiàng)解，產品僅用於科研使報告(gào)熒光基團和淬(cuì)滅熒光基(jī)團(tuán)分離(lí)，從而(ér)熒光監測係(xì)統可(kě)接(jiē)收到熒(yíng)光信號，即(jí)每擴增(zēng)一條(tiáo)DNA鏈，就有(yǒu)一個熒光分子(zǐ)形(xíng)成(chéng)，實現了(liǎo)熒(yíng)光信(xìn)號的累積與PCR產物的形成(chéng)wan全同步。
熒光(guāng)定(dìng)量(liáng)PCR實驗步驟(zhòu)：
①取凍(dòng)存(cún)已(yǐ)裂解的(dí)細(xì)胞，室(shì)溫放(fàng)置(zhì)5分鐘使其wan全(quán)溶(róng)解(jiě)。
②兩相(xiāng)分離 每1ml的(dí)TRIZOL試(shì)劑裂解的樣(yàng)品中(zhōng)加入0.2ml的(dí)lvfang，蓋(gài)緊管(guǎn)蓋(gài)。手動劇(jù)烈(liè)振(zhèn)蕩(dàng)管(guǎn)體15秒後，15到(dào)30℃孵育2到(dào)3分(fēn)鐘(zhōng)。4℃下(xià)12000rpm離(lí)心15分鐘。離(lí)心(xīn)後混合液體將分(fēn)為(wéi)下層的紅色(sè)酚lvfang相，中(zhōng)間層以(yǐ)及(jí)無色(sè)水(shuǐ)相上層。RNA全(quán)部(bù)被(bèi)分配(pèi)於水相中。水相(xiāng)上(shàng)層(céng)的(dí)體積大(dà)約(yuē)是(shì)匀(yún)漿時加(jiā)入(rù)的(dí)TRIZOL試劑的(dí)60%。
③RNA沉澱 將(jiāng)水相上(shàng)層轉移(yí)到一幹(gān)淨無(wú)RNA酶的(dí)離(lí)心(xīn)管(guǎn)中(zhōng)。加(jiā)等(děng)體積異丙醇混合(hé)以沉(chén)澱其中的RNA，混匀後(hòu)15到(dào)30℃孵育10分(fēn)鐘後(hòu)，於4℃下(xià)12000rpm 離心(xīn)10分鐘。此(cǐ)時離心(xīn)前(qián)不可見的RNA沉澱(diàn)將在管底(dǐ)部和(hé)側壁(bì)上形(xíng)成(chéng)膠狀(zhuàng)沉澱塊。
④RNA清洗(xǐ) 移去上清(qīng)液，每1mlTRIZOL試劑裂解的(dí)樣品中(zhōng)加入至少1ml的(dí)75%乙醇(chún)(75%乙醇用(yòng)DEPCH2O配(pèi)製)，清洗RNA沉(chén)澱(diàn)。混匀後，4℃下7000rpm離心5分鐘。
⑤RNA幹燥 小(xiǎo)心吸去(qù)大(dà)部分(fēn)乙醇溶(róng)液，使RNA沉(chén)澱在(zài)室溫空氣中(zhōng)幹(gān)燥5-10分鐘。
⑥溶解RNA沉(chén)澱 溶(róng)解(jiě)RNA時，先(xiān)加(jiā)入(rù)無RNA酶的水40μl用(yòng)槍(qiāng)反復(fù)吹打幾次(cì)，使(shǐ)其(qí)wan全溶解，獲(huò)得的RNA溶(róng)液(yè)保存於-80℃待用。 1)紫(zǐ)外吸收法測(cè)定先用(yòng)稀釋用的TE溶液將分(fēn)光光度計調(tiáo)零。然後取少量(liáng)RNA溶(róng)液用TE稀釋(shì)(1:100)後(hòu)，讀(dú)取(qǔ)其(qí)在(zài)分(fēn)光光度計260nm和280nm處的吸(xī)收值，測定RNA溶(róng)液(yè) 濃(nóng)度和(hé)純(chún)度。反(fǎn)應(yīng)五要(yào)素：
斯氏(shì)分(fēn)枝(zhī)杆菌(jūn)PCR檢測試劑盒費用參加PCR反應的物質主要有(yǒu)五(wǔ)種(zhǒng)即(jí)引(yǐn)物(wù)
，酶
，dNTP
，模板和Mg2+
引(yǐn)物(wù)：引(yǐn)物(wù)是PCR特(tè)異(yì)性反應(yīng)的關(guān)鍵(jiàn)，PCR 產物的特(tè)異性取決(jué)於(yú)引物與模(mó)板(bǎn)DNA互(hù)補(bǔ)的程度(dù)。理論上(shàng)，隻要(yào)知(zhī)道(dào)任何一(yī)段模板(bǎn)DNA序(xù)列(liè)， 就(jiù)能(néng)按其(qí)設(shè)計互補的寡(guǎ)核苷(gān)酸鏈做引物，利用PCR就可將模板(bǎn)DNA在(zài)體外(wài)大(dà)量擴增(zēng)。設(shè)計引物(wù)應遵(zūn)循(xún)以(yǐ)下原(yuán)則：
①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左(zuǒ)右。
②引物擴(kuò)增跨度(dù)： 以200-500bp為(wéi)宜，特(tè)定(dìng)條(tiáo)件下可(kě)擴增長(cháng)至(zhì)10kb的(dí)片段(duàn)。
③引物鹼(jiǎn)基：G+C含量(liáng)以(yǐ)40-60%為(wéi)宜(yí)，G+C太少擴增效(xiào)果不佳，G+C過多易出現非(fēi)特異(yì)條帶。ATGC隨(suí)機分(fēn)布(bù)，避免5個(gè)以(yǐ)上的(dí)嘌(piāo)呤(líng)或嘧啶核(hé)苷(gān)酸的(dí)成(chéng)串排(pái)列(liè)。
④避免(miǎn)引(yǐn)物(wù)內部出(chū)現二級(jí)結構，避免兩條引(yǐn)物間互(hù)補，特(tè)別(bié)是(shì)3'端(duān)的(dí)互補(bǔ)，否則會形成引(yǐn)物二(èr)聚體，產(chǎn)生非特異(yì)的擴(kuò)增(zēng)條帶(dài)。
⑤引物3'端(duān)的鹼(jiǎn)基(jī)，特別(bié)是(shì)末及(jí)倒(dǎo)數第(dì)二(èr)個鹼基，應(yīng)嚴格(gé)要求配對，以避免因末(mò)端鹼(jiǎn)基(jī)不(bù)配對而導(dǎo)致(zhì)PCR失敗(bài)。
⑥引(yǐn)物中有或能加(jiā)上合(hé)適的酶切(qiē)位點， 被擴增的(dí)靶(bǎ)序列有適(shì)宜的酶(méi)切位點， 這對(duì)酶(méi)切分析或分(fēn)子克(kè)隆(lóng)很(hěn)有好(hǎo)處(chǔ)。
⑦引(yǐn)物(wù)的特異性：引物應與核酸(suān)序列(liè)數據庫的其(qí)它(tā)序列無明(míng)顯(xiǎn)同源(yuán)性(xìng)。
引物量：每(měi)條引物(wù)的濃(nóng)度0.1～1umol或(huò)10～100pmol，以低(dī)引物(wù)量(liáng)產(chǎn)生所(suǒ)需要的(dí)結果(guǒ)為(wéi)好(hǎo)，引物濃度偏(piān)高會引起錯配(pèi)和非(fēi)特異(yì)性擴增，且可(kě)增加(jiā)引(yǐn)物(wù)之間(jiān)形成二聚體(tǐ)的機(jī)會(huì)。
 
 實驗(yàn)注(zhù)意(yì)事(shì)項：
 
1）RT-PCR可(kě)以檢(jiǎn)測組織
，細胞
，血(xiě)液
，細(xì)菌等(děng)很(hěn)多材料(liào)，不同(tóng)的樣本(běn)有不(bù)同要(yào)求，實(shí)驗前請充分(fēn)溝通(tōng)確認實驗(yàn)方案(àn)和樣(yàng)本情(qíng)況(kuàng)；
 
2）客(kè)戶(hù)盡(jìn)可能提供實驗(yàn)的背景(jǐng)信息
，物(wù)種
，基(jī)因(yīn)準確(què)的名稱(chēng)和(hé)ID號；
 
3）客戶(hù)盡(jìn)量(liáng)不要提(tí)供DNA或RNA樣品(pǐn)。
 
4）樣本保(bǎo)存於(yú)液氮或幹(gān)冰(bīng)，也可以保存於(yú)Trizol液(yè)中。
 
實時熒光(guāng)定(dìng)量(liáng)PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是指在(zài)PCR反應體係(xì)中加入(rù)熒光基團，利用熒光(guāng)信號(hào)積累(léi)實(shí)時(shí)監(jiān)測整(zhěng)個PCR進(jìn)程，*通過標準曲綫(xiàn)對未知(zhī)模(mó)板進(jìn)行(háng)定量(liáng)分析(xī)的(dí)方法。實時熒(yíng)光(guāng)定(dìng)量PCR的(dí)化學原理(lǐ)包(bāo)括(kuò)探針類(lèi)和非(fēi)探針類兩類(lèi)，探(tàn)針類(lèi)是(shì)利用(yòng)與(yǔ)靶(bǎ)細胞序(xù)列(liè)特(tè)異(yì)性雜交的探(tàn)針(zhēn)來(lái)指(zhǐ)示擴增產物(wù)的增加，非(fēi)探針類是利用(yòng)熒光(guāng)染(rǎn)料或(huò)者特異性(xìng)設(shè)計的引物來指(zhǐ)示(shì)擴(kuò)增(zēng)的增(zēng)加(jiā)。運(yùn)用(yòng)該(gāi)技(jì)術(shù)可以對DNA
，RNA樣品進行定量(liáng)（包括(kuò)*定量(liáng)和相對定量(liáng)）和(hé)定性(xìng)分析。
 
主要服務(wù)：DNA或RNA的*定量(liáng)分析
，基因(yīn)表(biǎo)達(dá)差異(yì)分(fēn)析(xī)
，基(jī)因分型。
 
主要技術(shù)：引物設計(jì)
，RNA提取
，cDNA合(hé)成
，qPCR。