產品特征(zhēng):
 
靈(líng)敏度(dù)高(gāo)：能對(duì)低拷貝或(huò)多(duō)樣性(xìng)模(mó)板進行(háng)定(dìng)量
。
特異(yì)性強：采用熱啟動(dòng)酶(méi)的(dí)激活(huó)機製(zhì)，抑製非特異性(xìng)擴增 
。
重復(fù)性(xìng)好：擴(kuò)增(zēng)曲(qū)綫(xiàn)重合度高(gāo)，受幹擾影響少(shǎo)
。
擴增效率(shuài)高(gāo)：擴(kuò)增曲綫Ct值低(dī)，起(qǐ)峰快，效率高
。
原(yuán)理:
所謂實時熒(yíng)光定(dìng)量PCR技術(shù)，是指在PCR反(fǎn)應體(tǐ)係中加(jiā)入(rù)熒(yíng)光基團，利(lì)用熒(yíng)光信號積(jī)累實時監(jiān)測(cè)整(zhěng)個PCR進程，後通過(guò)標(biāo)準曲綫對(duì)未知模板(bǎn)進行(háng)定量(liáng)分(fēn)析(xī)的(dí)方法(fǎ)
。
需要自備的(dí)器(qì)材：
1．儀器：分析天平(píng)，離心機，熒(yíng)光 PCR 擴增(zēng)儀，組織(zhī)研磨器(qì)，-20 ℃冰箱(xiāng)，可(kě)調移液(yè)器(qì)（2 µL，20µL，200 µL，1000 µL）
。
2．耗(hào)材：熒光 PCR 反(fǎn)應管(guǎn)，眼科剪，眼科(kē)鑷，生理鹽(yán)水(shuǐ)，1.5 mL 經焦碳酸二乙(yǐ)酯(zhǐ)（DEPC）水
處理的滅(miè)菌離(lí)心管，吸頭（10 µL，200 µL，1000 µL），滅(miè)菌雙(shuāng)蒸(zhēng)水(shuǐ)
。
具有下(xià)列特(tè)點(diǎn)：
1.產品僅(jǐn)用(yòng)於科研即開(kāi)即用(yòng)，用(yòng)戶隻需要提供樣品(pǐn) DNA 模(mó)板(bǎn)，操(cāo)作簡(jiǎn)單，定(dìng)量(liáng)準(zhǔn)確(què)快速(sù)
。
2. 引物(wù)經(jīng)過優化，特異(yì)性(xìng)強(qiáng)
。預期(qī)的(dí) PCR 產(chǎn)物(wù)長度為(wéi) 560 bp
。
3. PCR mix 中含(hán)上(shàng)樣染(rǎn)料，PCR 後可以直(zhí)接上(shàng)樣(yàng)電(diàn)泳(yǒng)
。
4. 提供陽性(xìng)對照，便(biàn)於(yú)分析試驗結果(guǒ)
。
檢測方(fāng)法(fǎ)：
1.Ⅰ法(fǎ)：
在(zài)PCR反(fǎn)應體係(xì)中(zhōng)，加(jiā)入過量SYBR熒(yíng)光(guāng)染料，SYBR熒光染料特異(yì)性地摻入DNA雙(shuāng)鏈後，發射(shè)熒光信號，而不(bù)摻(chān)入鏈(liàn)中的(dí)SYBR染(rǎn)料分(fēn)子(zǐ)不(bù)會(huì)發射(shè)任(rèn)何熒光信(xìn)號(hào)，從(cóng)而保證熒光信號的增(zēng)加(jiā)與(yǔ)PCR產物(wù)的增加(jiā)wan全同步(bù)
。
定量PCR擴增熒光曲(qū)綫圖
PCR產物熔解曲綫圖
2.TaqMan探針(zhēn)法：
探針完整時(shí)，報告(gào)基團(tuán)發(fā)射的(dí)熒(yíng)光信(xìn)號(hào)被淬(cuì)滅基(jī)團吸(xī)收；PCR擴增(zēng)時(shí)，Taq酶(méi)的(dí)5’-3’外切酶活(huó)性將探(tàn)針酶切降解(jiě)，產(chǎn)品僅(jǐn)用(yòng)於科(kē)研使(shǐ)報告熒光基團和(hé)淬滅熒(yíng)光(guāng)基(jī)團分(fēn)離，從(cóng)而熒光(guāng)監(jiān)測係統可接收(shōu)到(dào)熒(yíng)光信號，即每擴增(zēng)一條(tiáo)DNA鏈，就有(yǒu)一個(gè)熒(yíng)光(guāng)分(fēn)子形(xíng)成，實現(xiàn)了熒(yíng)光信號的(dí)累(léi)積(jī)與PCR產物(wù)的(dí)形成(chéng)wan全同(tóng)步(bù)
。
熒光(guāng)定量(liáng)PCR實驗步驟(zhòu)：
①取(qǔ)凍存(cún)已裂(liè)解的細(xì)胞(bāo)，室(shì)溫放(fàng)置5分(fēn)鐘使其wan全(quán)溶解(jiě)
。
②兩相分(fēn)離 每(měi)1ml的(dí)TRIZOL試劑裂解的樣品中(zhōng)加入0.2ml的(dí)lvfang，蓋緊管蓋
。手動劇(jù)烈振(zhèn)蕩管體(tǐ)15秒(miǎo)後，15到(dào)30℃孵育(yù)2到(dào)3分鐘(zhōng)
。4℃下12000rpm離(lí)心15分鐘(zhōng)
。離(lí)心(xīn)後(hòu)混合液(yè)體將(jiāng)分為下(xià)層的(dí)紅色(sè)酚(fēn)lvfang相(xiāng)，中間層以及無(wú)色水(shuǐ)相上層
。RNA全(quán)部(bù)被分配(pèi)於水(shuǐ)相(xiāng)中
。水相上層(céng)的體積(jī)大(dà)約是(shì)匀漿時(shí)加(jiā)入的(dí)TRIZOL試(shì)劑(jì)的60%
。
③RNA沉(chén)澱(diàn) 將水相(xiāng)上(shàng)層轉(zhuǎn)移到一幹淨無(wú)RNA酶的離(lí)心(xīn)管中
。加等體積異丙醇(chún)混合以沉澱其中(zhōng)的RNA，混匀(yún)後15到(dào)30℃孵育10分(fēn)鐘後(hòu)，於(yú)4℃下(xià)12000rpm 離心10分鐘(zhōng)
。此時離(lí)心前不可(kě)見(jiàn)的RNA沉(chén)澱(diàn)將在(zài)管底(dǐ)部和(hé)側壁(bì)上形成膠狀沉(chén)澱塊
。
④RNA清洗 移去上(shàng)清液，每(měi)1mlTRIZOL試劑裂(liè)解的樣品中(zhōng)加入(rù)至少1ml的(dí)75%乙醇(75%乙(yǐ)醇用DEPCH2O配(pèi)製(zhì))，清洗(xǐ)RNA沉澱(diàn)
。混匀(yún)後，4℃下(xià)7000rpm離(lí)心(xīn)5分鐘(zhōng)
。
⑤RNA幹燥(zào) 小心(xīn)吸去(qù)大部分乙(yǐ)醇溶液，使RNA沉澱(diàn)在室溫(wēn)空氣中(zhōng)幹(gān)燥5-10分鐘(zhōng)
。
⑥溶解(jiě)RNA沉澱 溶(róng)解(jiě)RNA時(shí)，先(xiān)加入無RNA酶的水40μl用槍反復吹(chuī)打(dǎ)幾(jī)次(cì)，使其(qí)wan全(quán)溶(róng)解，獲得的(dí)RNA溶液(yè)保存(cún)於-80℃待用
。 1)紫外吸(xī)收法(fǎ)測(cè)定先用稀(xī)釋(shì)用的TE溶(róng)液將分光(guāng)光度(dù)計(jì)調零
。然(rán)後(hòu)取少(shǎo)量RNA溶液用TE稀釋(1:100)後(hòu)，讀(dú)取其在(zài)分光光度(dù)計260nm和(hé)280nm處(chǔ)的吸(xī)收(shōu)值(zhí)，測定(dìng)RNA溶液 濃(nóng)度和純度(dù)
。反(fǎn)應五要(yào)素：
斯(sī)氏(shì)分(fēn)枝杆菌PCR檢測試(shì)劑(jì)盒(hé)費用參加PCR反應的物質主要有(yǒu)五(wǔ)種即引(yǐn)物，酶(méi)，dNTP，模板(bǎn)和Mg2+
引物：引(yǐn)物是(shì)PCR特異性反(fǎn)應的(dí)關鍵(jiàn)，PCR 產(chǎn)物的(dí)特(tè)異性(xìng)取(qǔ)決(jué)於(yú)引物(wù)與模(mó)板(bǎn)DNA互(hù)補的(dí)程(chéng)度(dù)
。理論上(shàng)，隻(zhī)要(yào)知道(dào)任何一段模板DNA序(xù)列， 就(jiù)能按(àn)其設(shè)計互補(bǔ)的(dí)寡核苷(gān)酸(suān)鏈做引物(wù)，利用(yòng)PCR就(jiù)可將(jiāng)模板(bǎn)DNA在體外大(dà)量(liáng)擴(kuò)增(zēng)
。設計引(yǐn)物應(yīng)遵循以下原(yuán)則：
①引物(wù)長度： 15-30bp，常用為(wéi)20bp左右
。
②引(yǐn)物(wù)擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為(wéi)宜，特定條件下(xià)可(kě)擴(kuò)增長至10kb的片段
。
③引物(wù)鹼(jiǎn)基：G+C含量以(yǐ)40-60%為(wéi)宜(yí)，G+C太少擴增(zēng)效果(guǒ)不佳，G+C過(guò)多易(yì)出現(xiàn)非(fēi)特(tè)異條帶
。ATGC隨機分布(bù)，避免5個以上的嘌(piāo)呤或嘧啶(dìng)核(hé)苷(gān)酸的(dí)成(chéng)串排列
。
④避(bì)免(miǎn)引物(wù)內部出現(xiàn)二(èr)級(jí)結構(gòu)，避(bì)免(miǎn)兩條引(yǐn)物(wù)間(jiān)互補，特(tè)別是3'端的互(hù)補，否則會形(xíng)成引物二聚體(tǐ)，產生非(fēi)特(tè)異(yì)的擴增條(tiáo)帶
。
⑤引物3'端(duān)的鹼基(jī)，特別(bié)是(shì)末(mò)及倒(dǎo)數第二個(gè)鹼基(jī)，應嚴(yán)格要(yào)求(qiú)配(pèi)對(duì)，以避(bì)免因(yīn)末(mò)端鹼(jiǎn)基(jī)不配(pèi)對而(ér)導致PCR失敗
。
⑥引(yǐn)物中(zhōng)有或(huò)能加上合(hé)適的酶切位(wèi)點(diǎn)， 被擴增的靶序列有適宜(yí)的酶切位(wèi)點， 這對酶(méi)切分析(xī)或分子克(kè)隆很(hěn)有(yǒu)好處
。
⑦引物(wù)的特異性(xìng)：引(yǐn)物(wù)應(yīng)與(yǔ)核(hé)酸(suān)序(xù)列數(shù)據庫(kù)的其它序列(liè)無(wú)明顯同源(yuán)性(xìng)
。
引物(wù)量(liáng)：每條(tiáo)引(yǐn)物的濃度0.1～1umol或(huò)10～100pmol，以(yǐ)低引物量(liáng)產(chǎn)生所(suǒ)需要(yào)的結果為好(hǎo)，引(yǐn)物濃度(dù)偏(piān)高會引起錯配(pèi)和(hé)非特異性擴增，且(qiě)可(kě)增加(jiā)引(yǐn)物之(zhī)間(jiān)形(xíng)成(chéng)二聚體的機會(huì)
。
 
 實驗注意事項：
 
1）RT-PCR可以檢測(cè)組(zǔ)織，細胞，血(xiě)液，細菌(jūn)等(děng)很多(duō)材料(liào)，不同(tóng)的樣本有(yǒu)不同要(yào)求，實(shí)驗前(qián)請充分溝(gōu)通確(què)認(rèn)實(shí)驗方案(àn)和樣(yàng)本(běn)情況；
 
2）客(kè)戶(hù)盡(jìn)可(kě)能(néng)提(tí)供實驗(yàn)的背景信(xìn)息，物種，基因(yīn)準確的(dí)名(míng)稱(chēng)和ID號(hào)；
 
3）客(kè)戶(hù)盡量(liáng)不要提供(gōng)DNA或(huò)RNA樣品
。
 
4）樣(yàng)本(běn)保存(cún)於液氮(dàn)或幹冰(bīng)，也可(kě)以保存(cún)於Trizol液中
。
 
實(shí)時熒光定(dìng)量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是(shì)指在(zài)PCR反應體(tǐ)係(xì)中加入(rù)熒光基團，利(lì)用(yòng)熒光信號積累實時(shí)監測整個(gè)PCR進程，*通(tōng)過標準(zhǔn)曲綫對未(wèi)知模(mó)板(bǎn)進(jìn)行(háng)定量(liáng)分析(xī)的方(fāng)法
。實時熒(yíng)光(guāng)定(dìng)量PCR的(dí)化(huà)學原理包括探(tàn)針(zhēn)類(lèi)和非探針類(lèi)兩(liǎng)類(lèi)，探(tàn)針(zhēn)類是(shì)利(lì)用與(yǔ)靶細(xì)胞序列特(tè)異(yì)性雜交的(dí)探(tàn)針來(lái)指示擴(kuò)增(zēng)產(chǎn)物的(dí)增加(jiā)，非(fēi)探針(zhēn)類是(shì)利用熒(yíng)光染(rǎn)料或者特異(yì)性設計(jì)的(dí)引(yǐn)物來指示擴(kuò)增的(dí)增加
。運用(yòng)該技(jì)術可以對DNA，RNA樣(yàng)品進(jìn)行定量（包(bāo)括(kuò)*定(dìng)量和相對(duì)定量）和定性分(fēn)析(xī)
。
 
主(zhǔ)要服務(wù)：DNA或RNA的*定量(liáng)分析，基(jī)因表(biǎo)達差異分析，基因分型
。
 
主要(yào)技術：引物設(shè)計(jì)，RNA提取，cDNA合(hé)成(chéng)，qPCR
。