隱襲腐黴探針法(fǎ)熒光定量PCR檢(jiǎn)測(cè)試(shì)劑(jì)盒使用方(fāng)法(fǎ)：
一，樣(yàng)品(pǐn)DNA的製(zhì)備(bèi)
用自選(xuǎn)方法(fǎ)提取(qǔ)細菌樣品(pǐn)DNA。注意：DNA純化(huà)方法(fǎ)是(shì)決(jué)定檢測靈敏(mǐn)度(dù)的關鍵因素(sù)。如(rú)果不能很(hěn)好純化樣品(pǐn)DNA，後麵(miàn)的PCR再靈敏也不能提高整體(tǐ)檢測(cè)靈(líng)敏度。
二，製備(bèi)O157:H7標準(zhǔn)曲(qū)綫(xiàn)（以10-10E6這(zhè)6個(gè)10倍稀(xī)釋度為例。由於(yú)標準(zhǔn)品(pǐn)濃(nóng)度非常(cháng)高，因此下(xià)列(liè)稀釋操(cāo)作一定(dìng)要在獨立的(dí)區(qū)域進行(háng)，千(qiān)萬不能(néng)汙染(rǎn)樣品(pǐn)或(huò)本(běn)試劑盒的其他成分(fēn)）。為增(zēng)加產品穩定性和避免擴散(sàn)傳染(rǎn)性病原(yuán)，本產(chǎn)品不提(tí)供(gōng)活(huó)體病(bìng)毒做(zuò)陽性(xìng)對(duì)照，隻提供沒(méi)有傳染(rǎn)性(xìng)的，可以直接使(shǐ)用(yòng)的(dí)DN段作為(wéi)陽性(xìng)對(duì)照。
1. 標記(jì)6個(gè)離心(xīn)管，分(fēn)別為6，5，4，3，2和(hé)1號(hào)。
2. 用帶芯槍頭分別加入(rù)45 μL超純水（用帶(dài)芯槍頭(tóu)，下(xià)同）。
3. 先將(jiāng)本試劑(jì)盒提(tí)供(gōng)的(dí)陽性對照(zhào)用TE緩(huǎn)衝液(yè)或(huò)超純(chún)水(shuǐ)10倍(bèi)梯度稀(xī)釋到(dào)10E7拷(kǎo)貝(bèi)/μL（注(zhù)：請(qǐng)不要將(jiāng)本試劑盒(hé)提(tí)供的(dí)標準(zhǔn)品(pǐn)一次(cì)性(xìng)稀釋至10E7拷(kǎo)貝(bèi)/μL，建(jiàn)議(yì)每次稀釋(shì)10倍(bèi)，梯度(dù)稀(xī)釋至10E7拷(kǎo)貝/μL）。
4. 在(zài)6號管中加(jiā)入5 μL 10E7拷(kǎo)貝/μL的(dí)O157:H7陽性對照(上(shàng)步(bù)稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得(dé)10E6拷貝(bèi)/μL的(dí)陽(yáng)性對照(zhào)。
5. 換(huàn)槍頭(tóu)，從6號(hào)管中(zhōng)取(qǔ)5 μL溶液(yè)到(dào)5號管(guǎn)中，充分震(zhèn)蕩1分(fēn)鐘，得(dé)10E5拷貝/μL的陽性(xìng)對(duì)照。
6. 換槍頭，從5號(hào)管中(zhōng)取5 μL溶(róng)液到4號(hào)管(guǎn)中(zhōng)，重復(fù)上麵(miàn)的操(cāo)作(zuò)直(zhí)到得(dé)到6個稀釋(shì)度(dù)的陽性對(duì)照。
7. NC管(guǎn)中(zhōng)不加任(rèn)何陽性對照。
8. 從1-6號管(guǎn)中(zhōng)分別取5 μL和(hé)待測(cè)樣品一(yī)起(qǐ)進(jìn)行定量PCR（見下步(bù)），每個(gè)樣品做3次重(zhòng)復。PCR後得(dé)到每(měi)個陽(yáng)性(xìng)對(duì)照稀(xī)釋樣(yàng)品的(dí)熒光PCR Ct值，並以之(zhī)為(wéi)縱軸，以(yǐ)濃度的對(duì)數值為(wéi)橫(héng)軸(zhóu)，繪製(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲(qū)綫(xiàn)。