布(bù)魯氏菌(jūn)（brucellosis）為病原(yuán)微(wēi)生(shēng)物(wù)，是一種(zhǒng)細胞(bāo)內寄(jì)生小球杆狀菌(jūn)，
革(gé)蘭氏染(rǎn)色陰(yīn)性，主要感(gǎn)染牛(niú)，羊，豬(zhū)，狗以及駱駝(tuó)，鹿(lù)等(děng)動物。布魯(lǔ)氏菌主要(yào)
是通過(guò)接(jiē)觸感染(rǎn)的動物或(huò)者吃(chī)被(bèi)感染的食物(wù)以(yǐ)及實驗(yàn)室(shì)接觸等(děng)方式傳播給人類，
能引起人(rén)和(hé)多種(zhǒng)動物的急(jí)性和慢(màn)急性(xìng)疾病，被(bèi)感染(rǎn)的人(rén)和動物表現為流(liú)產及不孕
不育等症狀(zhuàng)。
本試(shì)劑盒采用聚(jù)合酶鏈式(shì)反應(yīng)（PCR）結(jié)合 Taqman 技術，對布魯氏菌的
特異(yì)性 DNA 核(hé)酸(suān)片段進(jìn)行(háng)熒光檢(jiǎn)測，可用(yòng)於臨(lín)床(chuáng)對布魯(lǔ)氏菌的(dí)輔助診(zhěn)斷，使用(yòng)
方便，即開即用。血液，骨(gǔ)髓，關節腔(qiāng)液及(jí)病畜的組織(zhī)，奶，奶製品均(jūn)可作為(wéi)本
試劑(jì)盒的檢測(cè)標本(běn)。標本可(kě)立即(jí)用於檢(jiǎn)測(cè)，也可(kě)保存在-20℃待(dài)測。標本(běn)運(yùn)送應(yīng)
在(zài)低溫(wēn)條(tiáo)件(jiàn)下進行(háng)。

運輸及(jí)保存:

使(shǐ)用方法(fǎ):

一(yī)，標本，對照品的核(hé)酸(suān)裂解處(chǔ)理
1. 骨髓(suǐ)，關節腔(qiāng)液，血清等(děng)液(yè)態標本(běn)
：取(qǔ) 50 μL 樣(yàng)本(běn)，加(jiā)入 50 μL 核(hé)酸(suān)提取(qǔ)
液(yè)充分(fēn)混(hùn)匀(yún)，沸水浴(yù) 10 分鐘(zhōng)，然後 13,000 rpm 離(lí)心 10 分鐘，取上清 4
μL 作為(wéi) PCR 反(fǎn)應模(mó)板。
2. 全血 PBMC 分(fēn)離
：取抗凝血 1 mL，與 Hank’s 液（PBS 或生理鹽水）1
：
1 混(hùn)匀後，小(xiǎo)心(xīn)加於(yú) 2 mL 的(dí)細(xì)胞分離(lí)液(yè)的(dí)液麵(miàn)上(shàng)，2000 rpm 離心(xīn) 15 分
鐘(zhōng)（半徑(jìng) 15 cm 水平轉子），收集界(jiè)麵上(shàng)的細胞（中間呈白(bái)色(sè)層(céng)），置於(yú) 1.5
mL eppendorf 管中，2000 rpm 離(lí)心 10 分(fēn)鐘，棄(qì)上(shàng)清液。沉澱(diàn)中(zhōng)加入
50 μL 核(hé)酸提取(qǔ)液(yè)，振(zhèn)蕩(dàng) 10 秒，99℃幹(gān)浴(yù)或(huò)水(shuǐ)浴 10 分鐘，13,000 rpm
離(lí)心(xīn) 10 分鐘，保留(liú)上清備(bèi)用。
3. 奶(nǎi)標本(běn)
：取(qǔ)奶(nǎi) 3 mL ，13,000 rpm 離心 2 分鐘；棄去(qù)上清(qīng)，沉澱中直接
加入 100 μL DNA 提取液(yè)充分混匀，沸(fèi)水浴 10 分(fēn)鐘（誤差不超過(guò) 1 分鐘(zhōng)）。
13,000 rpm 離心 5 分鐘，取上清 4 μL 做(zuò) PCR 反應。
4. 超(chāo)純(chún)水(shuǐ)作為陰(yīn)性對(duì)照。如進(jìn)行(háng)定量(liáng)檢(jiǎn)測(cè)，陽性對(duì)照(zhào)品(pǐn)（1×107
copies/mL）需
要(yào)進(jìn)行(háng) 10，100，1000 倍(bèi)梯(tī)度稀(xī)釋。
二，試(shì)劑(jì)配製
取 n×35 μL 熒(yíng)光 PCR Mix 與(yǔ) n×1 μL 內部對照品，以及 n×0.4 μL 酶
（Taq+UNG）（n 為(wéi)反(fǎn)應管數(shù)），振(zhèn)蕩混匀(yún)數(shù)秒，3000 rpm 離心(xīn)數(shù)秒。（備注
：
如不使(shǐ)用(yòng)內(nèi)部(bù)對(duì)照(zhào)品(pǐn)，可(kě)用(yòng) n×1 μL 的超(chāo)純水(shuǐ)代替補足(zú)。）
三，加樣
取(qǔ)上述(shù)混合液 36 μL 置於薄壁 PCR 反應管(guǎn)或 PCR 反應板中，然(rán)後(hòu)將(jiāng)已處
理(lǐ)標本，陽性(xìng)對照(zhào)品(pǐn)，超純水(shuǐ)各 4 μL 分別加入薄壁 PCR 反應管或(huò) PCR 反應板(bǎn)
中，蓋(gài)好(hǎo)薄壁(bì) PCR 反應管蓋(gài)或 PCR 反(fǎn)應板(bǎn)膜(mó)，立(lì)即(jí)進行 PCR 擴增(zēng)反(fǎn)應(yīng)。
四(sì)，PCR 擴(kuò)增
反應(yīng)管置(zhì)於定量熒(yíng)光 PCR 儀上，推薦循環參(cān)數設置如下
：
過(guò)程 溫度(dù) 時間(jiān)
37℃ 2 分(fēn)鐘
預變性(xìng) 94℃ 2 分(fēn)鐘
PCR 反(fǎn)應
（40 個循環(huán)）
93℃ 15 s
60℃ 60 s
 單點熒光檢(jiǎn)測在(zài) 60℃。反(fǎn)應(yīng)體(tǐ)係 40μL。
熒光(guāng)通道(dào)檢測(cè)選(xuǎn)擇
：選(xuǎn)用(yòng) FAM 和 HEX （或 VIC/JOE）通道。
備注
：如使(shǐ)用 ABI 係列(liè) PCR 儀，請務必於(yú) passive reference 和 quencher
處均(jūn)選擇“none”。
五，基綫和閾(yù)值(zhí)設定(dìng)
基綫調整(zhěng)取(qǔ) 6-15 個循(xún)環(huán)的熒光信(xìn)號，閾值設(shè)定(dìng)原(yuán)則以閾值綫(xiàn)剛好(hǎo)超過超(chāo)純(chún)
水(shuǐ)檢(jiǎn)測熒(yíng)光曲(qū)綫的最(zuì)高點。
n×35 μL 混(hùn)合(hé)液(yè) + n×1 μL 內對照(zhào)+ n×0.4 μL 酶(méi)
n×36 μL分(fēn)裝 加 4 μL 模板
上機
+
六，校(xiào)準程(chéng)序(xù)
進(jìn)行(háng)定(dìng)量檢(jiǎn)測時需要進行(háng)校(xiào)準程序(xù)，陽(yáng)性對(duì)照(zhào)品處(chǔ)理(lǐ)和(hé)加(jiā)樣(yàng)在使用方(fāng)法的一
和二中已(yǐ)經(jīng)說(shuō)明；實(shí)驗結束(shù)後將(jiāng)陽性(xìng)對(duì)照品(pǐn)濃度輸(shū)入儀(yí)器軟件(jiàn)中，儀器(qì)自動生(shēng)成
標(biāo)準曲(qū)綫。
七，實際結果(guǒ)的(dí)判斷(duàn)
通道 Ct 值 結(jié)果判斷(duàn)
FAM UNDET 或 40 樣本(běn)低於檢測限，報(bào)告為(wéi)陰(yīn)性
FAM ≤38 報告為(wéi)陽(yáng)性(xìng)
FAM 38~40 復檢一次，如(rú)仍為 38~40，則(zé)報告為陰(yīn)性(xìng)
進行定量檢測時(shí)，儀器生(shēng)成(chéng)標準曲(qū)綫後，自動顯示待(dài)測樣品定(dìng)量值。