ELISA免疫標(biāo)記技(jì)術(shù)實(shí)驗步驟(zhòu)

HRP的製備

1).水提取：稱取5kg用(yòng)水衝刷幹淨的鮮辣根(辣根皮中亦(yì)含(hán)有(yǒu)豐富的HRP)，用(yòng)菜刀(dāo)切成(chéng)小碎(suì)塊(kuài)，在(zài)絞肉(ròu)機(jī)中絞碎(suì)1～2次(cì)。碎渣(zhā)漿(jiāng)用1倍體積(jī)的(dí)水低溫下攪拌提取(qǔ)過一夜(yè)(亦(yì)可采(cǎi)用高(gāo)速抽(chōu)提(tí)法)。次日用(yòng)甩幹機(jī)(或離心(xīn)機(jī))甩(shuǎi)幹，收集濾液(yè)，碎渣(zhā)再用(yòng)1/4倍(bèi)體積水浸(jìn)泡(pào)提(tí)取(qǔ)1次(cì)，合(hé)並(bìng)2次(cì)濾液(yè)，測(cè)得(dé)總體積(jī)。

2).硫(liú)酸(suān)銨(ǎn)分級分離：在不斷攪(jiǎo)拌下，每1000mL濾液中慢(màn)慢(màn)加入226g硫(liú)酸銨粉(fěn)末(相(xiāng)當(dāng)於(yú)0.40飽和度(dù)，0℃)，大約在(zài)1~2h內加完(wán)，置冷室中放(fàng)置(zhì)過(guò)一夜(yè)。次(cì)日將上清(qīng)液小(xiǎo)心(xīn)地用虹吸管移出，下(xià)麵(miàn)混(hùn)濁液(yè)以3 000r/min離心15min，棄沉澱(diàn)，合(hé)並上(shàng)清(qīng)液。再按每1000mL上(shàng)清液加258g硫酸(suān)銨粉(fěn)末(mò)(0.8飽(bǎo)和度)隨加(jiā)隨(suí)攪(jiǎo)拌，當(dāng)硫酸銨全部(bù)溶(róng)解後(hòu)，置冷室(shì)過(guò)一夜(yè)。次(cì)日，虹吸出上(shàng)清(qīng)液，沉澱部分(fēn)在(zài)冰凍離心(xīn)機中以13000r/min離心20min，棄去(qù)上清(qīng)液，收集(jí)沉澱(diàn)。將沉(chén)澱懸浮(fú)於(yú)100~150mL蒸餾(liù)水中(zhōng)(加水量(liáng)要(yào)使(shǐ)沉澱全(quán)部溶解為止)，分裝於(yú)透析袋(dài)內，放(fàng)在(zài)流動自(zì)來水(shuǐ)中進行透(tòu)析1～2天(tiān)，直到硫(liú)酸銨透析(xī)完畢(bì)為止(可用(yòng)5%乙酸鋇溶液或(huò)奈氏(shì)試(shì)劑進行(háng)檢查(chá))。然後改換成(chéng)用蒸餾(liù)水(shuǐ)透析，中間更換(huàn)2~3次(cì)，用0.1mol/L硝酸銀(yín)溶(róng)液檢查透析外液(yè)無氯(lǜ)離(lí)子為止。將透析(xī)液合並，在(zài)冰凍離心(xīn)機(jī)中以(yǐ)4 000r/min離心(xīn)15min，棄去(qù)沉澱(diàn)，量上清(qīng)液的體積(jī)。

3).丙(bǐng)酮分(fēn)級分離：將(jiāng)上(shàng)清(qīng)液(yè)倒(dǎo)入燒杯並置冰(bīng)鹽(yán)浴中，在不斷攪拌下(xià)，用細(xì)滴管(guǎn)沿杯壁加(jiā)入1倍(bèi)體積預冷至-15℃的(dí)丙酮(tóng)，放置(zhì)片刻，在(zài)冰凍(dòng)離心機中以(yǐ)4000r/min離(lí)心15min，棄(qì)去沉(chén)澱(diàn)。上(shàng)清(qīng)液(yè)再加入0.8體(tǐ)積(按原(yuán)上清液(yè)體(tǐ)積(jī))-15℃丙(bǐng)酮(tóng)，(操(cāo)作(zuò)同上)，靜(jìng)置後(hòu)，在(zài)冰(bīng)凍(dòng)離心(xīn)機中(zhōng)離心收集沉澱(diàn)。將(jiāng)沉澱(diàn)溶(róng)於(yú)少量蒸(zhēng)餾水中，透(tòu)析除去丙酮(tóng)。可(kě)得(dé)RZ值近於1的酶(méi)溶(róng)液。

4).精(jīng)製：將上步酶液(yè)適當稀釋(shì)，滴加(jiā)1mol/L硫酸(suān)鋅溶液(yè)，使酶(méi)液中(zhōng)鋅(xīn)離子濃(nóng)度(dù)為10 -3 mol/L，5 000r/min離心(xīn)10min，得上清液(yè)。再將(jiāng)沉澱用少(shǎo)量蒸餾水洗滌(dí)，離(lí)心，洗液與(yǔ)清(qīng)液合並，分裝於透(tòu)析(xī)袋(dài)內，用(yòng)水(shuǐ)透析(xī)除(chú)鹽，用微孔濾膜過(guò)濾，進行真空冰凍(dòng)幹(gān)燥(約得(dé)20mg)，產(chǎn)品呈米黃色(sè)纖維(wéi)狀鬆(sōng)軟(ruǎn)物，HRP產品的(dí)RZ值(zhí)可達3.0左(zuǒ)右(yòu)，置(zhì)真(zhēn)空幹燥器中(zhōng)低溫(wēn)保存。