優(yōu)化(huà)WB實(shí)驗(yàn)條件驗(yàn)證Anti-ACA11抗(kàng)體，需圍繞(rào)‌ACA11蛋白（分子量112kDa，植物膜定位(wèi)鈣轉(zhuǎn)運蛋白）‌特(tè)性針對性調整(zhěng)，具(jù)體(tǐ)方(fāng)案(àn)如(rú)下：
一(yī)，樣(yàng)品製(zhì)備環節優(yōu)化
‌裂解(jiě)條件(jiàn)‌：擬(nǐ)南芥樣本(běn)全程冰上(shàng)操作，使用(yòng)含(hán)蛋白(bái)酶(méi)抑(yì)製(zhì)劑的(dí)RIPA裂解(jiě)液裂解30分(fēn)鐘，期間間(jiān)歇渦旋(xuán)混(hùn)匀，之後4℃，12000g離(lí)心15分(fēn)鐘取(qǔ)上清(qīng)，避(bì)免(miǎn)蛋白降解。
‌上(shàng)樣量調(tiáo)整(zhěng)‌：為(wéi)了(liǎo)驗證抗(kàng)體有(yǒu)效(xiào)性，可設置(zhì)梯度上樣量(liáng)：10μg，30μg，50μg總(zǒng)蛋(dàn)白，便(biàn)於觀察(chá)不(bù)同(tóng)蛋(dàn)白濃(nóng)度下的條帶情況，常規(guī)驗證推薦(jiàn)30μg總(zǒng)蛋(dàn)白上樣。
‌變(biàn)性(xìng)處(chǔ)理(lǐ)‌：使(shǐ)用含(hán)DTT還(huán)原劑的上樣緩衝(chōng)液，95℃加(jiā)熱(rè)變(biàn)性5-10分(fēn)鐘，確保蛋白(bái)充分(fēn)變性(xìng)，保證(zhèng)抗(kàng)體識(shí)別位點暴(bào)露。
二，電(diàn)泳(yǒng)與(yǔ)轉(zhuǎn)膜條件(jiàn)優(yōu)化
‌凝膠選擇‌：ACA11分(fēn)子量(liáng)為112kDa，優先(xiān)選擇8%分(fēn)離膠(jiāo)的SDS-PAGE膠(jiāo)，可(kě)保(bǎo)證大(dà)分(fēn)子量蛋白(bái)充(chōng)分分離，避免條帶(dài)壓縮(suō)模糊。
‌轉(zhuǎn)膜參數‌：推薦恒(héng)流250mA轉(zhuǎn)印75分(fēn)鐘(zhōng)，全(quán)程冰浴(yù)降(jiàng)溫防止(zhǐ)蛋(dàn)白降(jiàng)解(jiě)；選(xuǎn)擇0.45μm孔徑的PVDF膜(mó)，轉(zhuǎn)膜前用(yòng)甲(jiǎ)醇(chún)活(huó)化30秒，提(tí)升(shēng)蛋白(bái)結合能力(lì)。
三，封(fēng)閉(bì)與(yǔ)抗(kàng)體孵育優(yōu)化(huà)
‌封閉(bì)選擇‌：優先采(cǎi)用(yòng)5%脫脂(zhī)奶(nǎi)粉(fěn)TBST溶液室(shì)溫(wēn)封閉(bì)1小時；若(ruò)背(bèi)景(jǐng)偏高，換為3%BSA封閉(bì)，減(jiǎn)少非(fēi)特異(yì)性結(jié)合(hé)。
‌抗體濃(nóng)度梯度‌：驗證時必(bì)須設(shè)置濃度(dù)梯度，推薦(jiàn)設(shè)置(zhì)1:200，1:500，1:1000，1:2000四個稀(xī)釋比(bǐ)例(lì)，4℃搖(yáo)床(chuáng)孵育過夜，對(duì)比(bǐ)不(bù)同(tóng)濃度的條帶效果確(què)定(dìng)最佳工(gōng)作濃度(dù)。
‌二抗(kàng)匹配‌：Anti-ACA11多為(wéi)兔源(yuán)一(yī)抗，選(xuǎn)擇(zé)HRP標(biāo)記的(dí)羊(yáng)抗(kàng)兔二抗(kàng)，稀釋(shì)比(bǐ)例推薦(jiàn)1:5000-1:10000，室溫(wēn)孵育(yù)1小(xiǎo)時即(jí)可。
四(sì)，洗(xǐ)滌(dí)與顯影優(yōu)化(huà)
‌洗(xǐ)滌(dí)操(cāo)作‌：一(yī)抗，二抗(kàng)孵(fū)育完成後(hòu)，均用0.1%TBST洗(xǐ)滌3次，每次(cì)10分鐘，緩慢(màn)搖床(chuáng)振蕩，充(chōng)分洗去未結合的遊離(lí)抗體，降(jiàng)低背景(jǐng)。
‌顯(xiǎn)影(yǐng)策(cè)略‌：采用梯(tī)度(dù)曝光(guāng)，依次曝光5秒，30秒，2分(fēn)鐘，避免(miǎn)過曝或(huò)曝光(guāng)不足，方便(biàn)準(zhǔn)確(què)判斷(duàn)條帶特異(yì)性。
五(wǔ)，驗證(zhèng)對照(zhào)設(shè)置（關(guān)鍵(jiàn)）
必須同(tóng)時設置(zhì)兩類對照(zhào)才能(néng)準確驗證(zhèng)：
陽性對照(zhào)：擬南芥野生(shēng)型樣本，確認抗體(tǐ)能結(jié)合(hé)目標蛋白
陰性(xìng)對(duì)照：aca11敲除突變體或(huò)同(tóng)型IgG替(tì)代一(yī)抗(kàng)，排除(chú)非(fēi)特(tè)異(yì)性(xìng)結合(hé)