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血液(yè)RNA提(tí)取的方法(fǎ)有(yǒu)哪(nǎ)兩類(lèi)及(jí)它們的注意(yì)事(shì)項(xiàng)
血液RNA提取的(dí)方(fāng)法(fǎ)可以細分(fēn)為(wéi)需要(yào)預(yù)先處理(lǐ)和不需(xū)要(yào)預先處(chǔ)理(lǐ)兩類。
眾(zhòng)所(suǒ)周知,人(rén)和(hé)其他(tā)哺乳(rǔ)動物(wù)血液隻(zhī)有白(bái)細胞(bāo)(不到總(zǒng)數(shù)的(dí) 5%)等(děng)少(shǎo)量(liáng)細(xì)胞含有RNA,需要預先處(chǔ)理(lǐ)的(dí)血(xiě)液 RNA 提取法其實就是(shì)分(fēn)離(lí)白(bái)細胞再(zài)提取RNA, 本質上(shàng)是白細胞RNA提(tí)取。分(fēn)離白(bái)細胞的(dí)方(fāng)法有 Ficoll-Hypaque 密度(dù)離(lí)心(xīn)法(fǎ)(白細胞(bāo)在 Buffy Coat 中)和紅(hóng)細(xì)胞(bāo)裂解(jiě)法。由(yóu)於預處理操作會(huì)劇烈改(gǎi)變血(xiě)液(yè)RNA含量(liáng)(British J. Haematol., 126:231, 2004),所以無預(yù)處(chǔ)理(lǐ) 提(tí)取法(fǎ)將(jiāng)是未來(lái)提(tí)取血(xiě)液RNA的發(fā)展方(fāng)向(xiàng)。
白細胞RNA提(tí)取和(hé)全血(xiě)RNA提取都需注意以下(xià)問(wèn)題(tí):
一(yī),血(xiě)液越新(xīn)鮮越 好,因(yīn)血液細(xì)胞(bāo)內外都有(yǒu)大量 RNase,容易使(shǐ)RNA降解。血液在(zài) 4℃的(dí)放置 時間最好不要(yào)超過四(sì)天;
二(èr),盡可能抑製或滅活(huó)血液特有的(dí)RNase(如 EDN, ECP),因為(wéi)它們不但(dàn)跟 RNase A 一樣非常(cháng)穩定(dìng),而(ér)且(qiě)不被 RNase Inhibitor 和 RVC 抑製(zhì),還能(néng)抑製逆轉錄(lù)酶(méi)的活(huó)性,它們(mén)殘(cán)留(liú)在RNA樣品中不(bù)但會(huì)降解RNA,還會幹(gān)擾(rǎo)後續的(dí)RT-PCR反(fǎn)應;
三,血液富(fù)含糖(táng)蛋白,粘(nián)蛋白(bái)和(hé)血紅(hóng)蛋白,提取需要去除(chú)糖蛋白(bái)汙染;
四,由(yóu)於RNA量少,提取時很容易丟失, 可以(yǐ)適(shì)當使用核酸(suān)沉(chén)澱助(zhù)沉劑(jì);
五,血(xiě)液(yè)細胞量隨生理病理因素(sù)變化波動性(xìng)大, 注意調整(zhěng)血液和提取試劑的最佳用量(liáng)。 最簡(jiǎn)單的方法是使用已經(jīng)經過(guò)廠(chǎng)家優化的產(chǎn)品,比(bǐ)如用於白細胞(bāo)RNA提(tí)取的(dí) TRIzol,QIAamp RNA Blood Mini Kit 和xuanya的(dí)動物 RNAOUT;用於全(quán)血(xiě)RNA 提(tí)取(qǔ)的 TRIzol LS,PAXgene Blood RNA Kit 和(hé)xuanya的(dí)全血RNAOUT和柱(zhù)式(shì)血液RNAOUT。
眾(zhòng)所(suǒ)周知,人(rén)和(hé)其他(tā)哺乳(rǔ)動物(wù)血液隻(zhī)有白(bái)細胞(bāo)(不到總(zǒng)數(shù)的(dí) 5%)等(děng)少(shǎo)量(liáng)細(xì)胞含有RNA,需要預先處(chǔ)理(lǐ)的(dí)血(xiě)液 RNA 提取法其實就是(shì)分(fēn)離(lí)白(bái)細胞再(zài)提取RNA, 本質上(shàng)是白細胞RNA提(tí)取。分(fēn)離白(bái)細胞的(dí)方(fāng)法有 Ficoll-Hypaque 密度(dù)離(lí)心(xīn)法(fǎ)(白細胞(bāo)在 Buffy Coat 中)和紅(hóng)細(xì)胞(bāo)裂解(jiě)法。由(yóu)於預處理操作會(huì)劇烈改(gǎi)變血(xiě)液(yè)RNA含量(liáng)(British J. Haematol., 126:231, 2004),所以無預(yù)處(chǔ)理(lǐ) 提(tí)取法(fǎ)將(jiāng)是未來(lái)提(tí)取血(xiě)液RNA的發(fā)展方(fāng)向(xiàng)。
白細胞RNA提(tí)取和(hé)全血(xiě)RNA提取都需注意以下(xià)問(wèn)題(tí):
一(yī),血(xiě)液越新(xīn)鮮越 好,因(yīn)血液細(xì)胞(bāo)內外都有(yǒu)大量 RNase,容易使(shǐ)RNA降解。血液在(zài) 4℃的(dí)放置 時間最好不要(yào)超過四(sì)天;
二(èr),盡可能抑製或滅活(huó)血液特有的(dí)RNase(如 EDN, ECP),因為(wéi)它們不但(dàn)跟 RNase A 一樣非常(cháng)穩定(dìng),而(ér)且(qiě)不被 RNase Inhibitor 和 RVC 抑製(zhì),還能(néng)抑製逆轉錄(lù)酶(méi)的活(huó)性,它們(mén)殘(cán)留(liú)在RNA樣品中不(bù)但會(huì)降解RNA,還會幹(gān)擾(rǎo)後續的(dí)RT-PCR反(fǎn)應;
三,血液富(fù)含糖(táng)蛋白,粘(nián)蛋白(bái)和(hé)血紅(hóng)蛋白,提取需要去除(chú)糖蛋白(bái)汙染;
四,由(yóu)於RNA量少,提取時很容易丟失, 可以(yǐ)適(shì)當使用核酸(suān)沉(chén)澱助(zhù)沉劑(jì);
五,血(xiě)液(yè)細胞量隨生理病理因素(sù)變化波動性(xìng)大, 注意調整(zhěng)血液和提取試劑的最佳用量(liáng)。 最簡(jiǎn)單的方法是使用已經(jīng)經過(guò)廠(chǎng)家優化的產(chǎn)品,比(bǐ)如用於白細胞(bāo)RNA提(tí)取的(dí) TRIzol,QIAamp RNA Blood Mini Kit 和xuanya的(dí)動物 RNAOUT;用於全(quán)血(xiě)RNA 提(tí)取(qǔ)的 TRIzol LS,PAXgene Blood RNA Kit 和(hé)xuanya的(dí)全血RNAOUT和柱(zhù)式(shì)血液RNAOUT。
