小(xiǎo)鼠骨(gǔ)髓(suǐ)染紅(hóng)細胞(bāo)微核(hé)的測(cè)定(dìng)方法(fǎ)

實驗(yàn)原理

染色單(dān)體或(huò)染(rǎn)色體(tǐ)的無著絲(sī)點(diǎn)斷(duàn)片(piàn)
，或因(yīn)紡錘體受(shòu)損而丟失(shī)的(dí)整個染色(sè)體
，在細胞分(fēn)裂後期
，仍(réng)然遺(yí)留在(zài)細胞(bāo)質(zhì)中(zhōng)。末期之後
，單獨形(xíng)成一個或(huò)幾(jī)個規(guī)則的次核
，被(bèi)包含在子(zǐ)細胞(bāo)的胞質(zhì)內(nèi)
，因比(bǐ)主核(hé)小
，故稱(chēng)為微核。大小應(yīng)為(wéi)主(zhǔ)核(hé)的1/20～1/5。微(wēi)核的折(zhē)光(guāng)率及細(xì)胞化學反應(yīng)性(xìng)質和主(zhǔ)核一(yī)樣(yàng)。微(wēi)核(hé)率是和用藥的劑(jì)量(liáng)或輻射(shè)累(léi)積(jī)效應呈正相(xiāng)關(guān)
，所以可(kě)用(yòng)簡(jiǎn)易的，快速(sù)，靈敏的(dí)微核(hé)計(jì)數來代(dài)替繁雜(zá)的(dí)畸(jī)變染(rǎn)色體計數。Matter 和Schmid建立(lì)的(dí)微(wēi)核(hé)測試(shì)是一種比較(jiào)理想的(dí)方法(fǎ)
，目(mù)前國內外(wài)已把(bǎ)微核測試用於輻(fú)射損傷(shāng)，化學誘(yòu)變劑，新藥試驗，染色(sè)體(tǐ)遺(yí)傳疾病及(jí)癌(ái)症前期(qī)診斷等(děng)各方麵(miàn)。

實驗對象

成年(nián)健(jiàn)康(kāng)小鼠
，體(tǐ)重(zhòng)25g左右
，雌(cí)雄均可(kě)。

實驗試(shì)劑(jì)與器材(cái)

（1）器材：顯微鏡，低速離(lí)心(xīn)機，電子(zǐ)天平，解(jiě)剖(pōu)器(qì)械（搪(táng)瓷(cí)解(jiě)剖(pōu)盤，探(tàn)針，剪刀(dāo)，鑷(niè)子(zǐ)），注(zhù)射器，試(shì)管(guǎn)，試(shì)管架，磨(mó)口(kǒu)試劑瓶，滴管，染色缸(gāng)，洗(xǐ)耳(ěr)球(qiú)，量(liáng)筒，清潔載玻片。

（2）試劑：0.9％生理鹽水，滅(miè)活(huó)的小牛血清，環磷(lín)酰胺，甲醇(chún)，PBS (pH6.8)，Giemsa染液，瑞氏(shì)染(rǎn)液(yè)。

實驗方(fāng)法(fǎ)與步驟(zhòu)

（1）環(huán)磷(lín)酰(xiān)胺處理(lǐ)：取(qǔ)骨(gǔ)髓(suǐ)前24h先給(gěi)小(xiǎo)鼠腹腔注入環(huán)磷(lín)酰胺
，注(zhù)射劑(jì)量(liáng)為100mg／kg動物體重。

（2）取(qǔ)骨(gǔ)髓：用(yòng)損(sǔn)傷脊(jǐ)髓法處死(sǐ)小鼠(shǔ)
，然後(hòu)用(yòng)剪刀剪開(kāi)大腿上的(dí)皮(pí)膚和肌(jī)肉
，取(qǔ)出大腿骨
，用一小(xiǎo)塊紗(shā)布(bù)來(lái)回搓幹(gān)淨附在(zài)骨(gǔ)上的肌肉碎渣。剪(jiǎn)掉股(gǔ)骨兩端膨大的(dí)關(guān)節(jié)頭
，然(rán)後用(yòng)注射器吸取5ml生理鹽水(shuǐ)
，插(chā)入(rù)股骨(gǔ)一(yī)端(duān)
，將骨髓(suǐ)細胞(bāo)衝洗至10ml的離心(xīn)管(guǎn)中。可重(zhòng)復衝洗多(duō)次
，直至(zhì)骨髓(suǐ)腔呈白(bái)色(sè)為止。

（3）離(lí)心處理：將(jiāng)所(suǒ)獲得的細胞(bāo)懸浮(fú)液以1000rpm離心(xīn)10min
，吸去上(shàng)清液(yè)
，在沉澱物中加入(rù)2滴滅活的(dí)小(xiǎo)牛(niú)血清(qīng)
，製(zhì)成(chéng)細胞(bāo)懸液。

（4）塗片：滴一滴(dī)懸(xuán)液於載玻(bō)片一端(duān)
，按(àn)常規方法塗(tú)片(piàn)
，在(zài)空氣中(zhōng)晾幹。

（5）固定(dìng)：將(jiāng)晾幹(gān)的(dí)載玻片放(fàng)入(rù)甲(jiǎ)醇固定(dìng)液中10min
，取出晾幹(gān)。

（6）染色：將製(zhì)片平(píng)放在(zài)玻(bō)璃(lí)板上
，用1∶9∶10的(dí)Giemsa∶PBS∶瑞氏染液(yè)
，染色15min
，流水衝洗(xǐ)後晾幹(gān)即可(kě)鏡(jìng)檢。

（7）觀察：嗜多染(rǎn)紅細(xì)胞(bāo)為年幼紅細(xì)胞
，呈(chéng)灰(huī)藍色
，略大於(yú)紅細(xì)胞（紅色(sè)）
，微核多呈圓形和(hé)橢圓(yuán)形
，呈藍紫(zǐ)色(sè)或(huò)紫紅(hóng)色（圖13-3）。

（8）結果分析(xī)：在顯微(wēi)鏡下
，每隻小(xiǎo)鼠骨髓塗片(piàn)標本計(jì)數(shù)1000~2000個(gè)嗜多染紅(hóng)細胞
，包括其(qí)中出現微核(hé)的(dí)細(xì)胞(bāo)數(shù)
，將結果填(tián)入表內
，並計(jì)算(suàn)微核細(xì)胞率
，觀察記錄(lù)結果(guǒ)（表(biǎo)13-2）。按(àn)100mg/kg體(tǐ)重劑量給(gěi)小鼠腹腔注射環磷酰胺(àn)
，其嗜(shì)多染紅(hóng)細胞(bāo)微(wēi)核(hé)率為（48.9±3.6）％。正常小(xiǎo)鼠嗜(shì)多(duō)染紅(hóng)細胞微核(hé)率為5‰以(yǐ)下
，超過(guò)5‰為異常(cháng)。