飾(shì)紋(wén)汀蛙虹(hóng)彩(cǎi)病毒 PCR 檢(jiǎn)測試劑(jì)盒檢測方法：

1.Ⅰ法：

在(zài)PCR反(fǎn)應(yīng)體(tǐ)係中，加(jiā)入(rù)過量SYBR熒光染(rǎn)料，SYBR熒光染料特(tè)異性地(dì)摻入DNA雙鏈後(hòu)，發射(shè)熒(yíng)光信號(hào)，而不摻(chān)入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任(rèn)何熒光(guāng)信號，從而保(bǎo)證熒(yíng)光(guāng)信(xìn)號(hào)的(dí)增加與PCR產物的增(zēng)加(jiā)完全(quán)同(tóng)步(bù)
。

定量(liáng)PCR擴增熒(yíng)光(guāng)曲(qū)綫圖

PCR產物(wù)熔(róng)解曲綫圖

2.TaqMan探(tàn)針法：

探(tàn)針完(wán)整時(shí)，報(bào)告(gào)基(jī)團發(fā)射(shè)的熒光信(xìn)號(hào)被(bèi)淬(cuì)滅基(jī)團吸(xī)收(shōu)；PCR擴增時(shí)，Taq酶的5’-3’外切酶活性(xìng)將(jiāng)探針酶切降(jiàng)解，使(shǐ)報告(gào)熒(yíng)光基團(tuán)和淬滅熒光(guāng)基團分(fēn)離(lí)，從而熒(yíng)光(guāng)監(jiān)測係統可接(jiē)收(shōu)到(dào)熒(yíng)光信(xìn)號，即每擴增一條DNA鏈，就(jiù)有一個熒(yíng)光分子形成(chéng)，實(shí)現了熒光(guāng)信號的累積(jī)與(yǔ)PCR產(chǎn)物(wù)的形成完全(quán)同步
。

取凍(dòng)存(cún)已裂(liè)解(jiě)的細胞，室(shì)溫(wēn)放(fàng)置5分(fēn)鐘使(shǐ)其完全(quán)溶解(jiě)
。

②兩(liǎng)相(xiāng)分離 每(měi)1ml的(dí)TRIZOL試劑(jì)裂解(jiě)的樣品中加(jiā)入0.2ml的lvfang，蓋緊管(guǎn)蓋
。手(shǒu)動劇烈振(zhèn)蕩管體(tǐ)15秒(miǎo)後(hòu)，15到(dào)30℃孵(fū)育2到(dào)3分鐘(zhōng)
。4℃下(xià)12000rpm離(lí)心15分(fēn)鐘(zhōng)
。離心(xīn)後混合(hé)液體將分為(wéi)下層(céng)的(dí)紅(hóng)色酚lvfang相，中(zhōng)間層以及(jí)無色水(shuǐ)相上層
。RNA全(quán)部(bù)被(bèi)分(fēn)配於(yú)水相(xiāng)中
。水相上(shàng)層的(dí)體(tǐ)積大約(yuē)是(shì)匀漿時加(jiā)入(rù)的(dí)TRIZOL試劑的(dí)60%
。

③RNA沉澱 將(jiāng)水相上(shàng)層轉移到一幹淨無RNA酶的離心(xīn)管中(zhōng)
。加等(děng)體積(jī)yibing醇混合(hé)以(yǐ)沉澱其(qí)中的RNA，混(hùn)匀後(hòu)15到(dào)30℃孵(fū)育10分鐘(zhōng)後，於4℃下(xià)12000rpm 離心10分鐘
。此時離(lí)心(xīn)前(qián)不可(kě)見(jiàn)的RNA沉(chén)澱(diàn)將在管底部和側壁上形成膠狀沉澱(diàn)塊(kuài)
。

④RNA清洗 移(yí)去上(shàng)清液(yè)，每1mlTRIZOL試劑(jì)裂解(jiě)的樣品(pǐn)中(zhōng)加入至少1ml的(dí)75%yi醇(75%yi醇用(yòng)DEPCH2O配製)，清洗RNA沉澱
。混(hùn)匀後，4℃下7000rpm離心5分(fēn)鐘
。

⑤RNA幹燥 小(xiǎo)心吸去(qù)大部(bù)分(fēn)yi醇溶(róng)液(yè)，使(shǐ)RNA沉(chén)澱(diàn)在室(shì)溫(wēn)空氣中幹(gān)燥5-10分鐘
。

⑥溶解RNA沉澱(diàn) 溶解RNA時(shí)，先(xiān)加入無RNA酶的(dí)水(shuǐ)40μl用(yòng)槍(qiāng)反(fǎn)復(fù)吹打幾(jī)次，使(shǐ)其(qí)完全溶解，獲得(dé)的RNA溶液保(bǎo)存於-80℃待(dài)用(yòng)
。 1)紫外(wài)吸收(shōu)法(fǎ)測(cè)定先(xiān)用(yòng)稀釋(shì)用的TE溶液(yè)將(jiāng)分(fēn)光光(guāng)度計(jì)調零
。然(rán)後(hòu)取少量RNA溶液用TE稀(xī)釋(1:100)後(hòu)，讀(dú)取(qǔ)其在(zài)分光光度計260nm和(hé)280nm處(chǔ)的吸收(shōu)值，測定RNA溶液 濃(nóng)度(dù)和(hé)純(chún)度(dù)
。