試驗(yàn)原理
：

是(shì)固相夾心法酶聯(lián)免(miǎn)疫(yì)吸附(fù)實驗（ELISA）.已(yǐ)知待測(cè)物(wù)質(zhì)濃度的(dí)標準品(pǐn)
，未知濃度的樣品加入微(wēi)孔(kǒng)酶(méi)標板(bǎn)內進(jìn)行檢測(cè)
。先(xiān)將待測物質和生物素標(biāo)記(jì)的抗(kàng)體同時溫(wēn)育(yù)
。洗滌後(hòu)，加入親(qīn)和素標記(jì)過(guò)的(dí)HRP
。再經(jīng)過溫育(yù)和(hé)洗(xǐ)滌(dí)，去除(chú)未(wèi)結合的酶結(jié)合物，然(rán)後加(jiā)入(rù)底物(wù)A
，B，和(hé)酶結合物(wù)同時(shí)作(zuò)用(yòng)
。產生顏(yán)色(sè)
。顏(yán)色(sè)的深(shēn)淺和(hé)樣(yàng)品(pǐn)中(zhōng)待(dài)測物(wù)質的濃(nóng)度呈(chéng)比(bǐ)例關係
。
分析類型
：夾心ELISA

樣本類型
：血清
，血漿(jiāng)
，組(zǔ)織
，尿液
，及相關(guān)液(yè)體等(děng)樣本

產品型(xíng)式(shì)
：48/96孔板(bǎn)，可(kě)拆(chāi)

貯(zhù)存方法
：試(shì)劑(jì)盒未拆開(kāi)，4℃保(bǎo)存
。已(yǐ)拆開(kāi)，標準(zhǔn)品-20℃保存，其它(tā)4℃保存
。

運輸條(tiáo)件
：4℃

樣(yàng)本體積(jī)
：50μl
自(zì)備材料

1）蒸(zhēng)餾(liù)水(shuǐ)
。

2）酶(méi)標(biāo)儀(450nm）

3）高(gāo)精度加樣(yàng)及槍(qiāng)頭(tóu)
：0.5-10uL
，2-20uL
，20-200uL
，200-1000uL

4）振(zhèn)蕩(dàng)器及磁(cí)力(lì)攪拌(bàn)器等(děng)
。5）37℃恒溫箱
。

 
安(ān)全性

1）避免直接接觸終止液(yè)和底(dǐ)物A
，B
。一(yī)旦(dàn)接觸(chù)到(dào)這些(xiē)液體，請(qǐng)盡快(kuài)用水衝(chōng)洗
。

2）實驗(yàn)中(zhōng)不要吃喝
，抽煙或(huò)使用化(huà)妝品(pǐn)
。

3）不(bù)要用嘴吸取試劑(jì)盒裏(lǐ)的(dí)任何成份
。


樣品收集(jí)
，處理(lǐ)及保存方法

1）血清(qīng)－－－－-操(cāo)作(zuò)過程中(zhōng)避(bì)免(miǎn)任何細(xì)胞(bāo)刺(cì)激
。使(shǐ)用不(bù)含熱原(yuán)和內(nèi)毒素的試(shì)管
。收集(jí)血液(yè)後，1000×g離心(xīn)10分鐘(zhōng)將(jiāng)血清和(hé)紅細(xì)胞迅速小心地分離(lí)
。

2）血(xiě)漿－－－－-EDTA
，檸檬酸(suān)鹽(yán)
，肝(gān)素血漿可用(yòng)於(yú)檢測(cè)
。1000×g離(lí)心(xīn)30分鐘去(qù)除顆粒
。

3）細胞上清液－－-1000×g離心10分鐘去(qù)除顆粒和聚合物(wù)
。

4）組(zǔ)織匀(yún)漿(jiāng)－－－－-將組(zǔ)織(zhī)加入適(shì)量生理(lǐ)鹽水搗碎
。1000×g離(lí)心10分(fēn)鐘，取(qǔ)上(shàng)清(qīng)液

5）保存－－－－－－如果(guǒ)樣品(pǐn)不(bù)立即使(shǐ)用(yòng)，應將(jiāng)其分(fēn)成(chéng)小部分(fēn)-70 ℃保(bǎo)存(cún)，避(bì)免反復冷(lěng)凍
。盡可(kě)能的不要使(shǐ)用(yòng)溶(róng)血(xiě)或高血脂血(xiě)
。如(rú)果(guǒ)血(xiě)清(qīng)中大量(liáng)顆(kē)粒(lì)，檢測前先(xiān)離心或(huò)過(guò)濾
。不(bù)要(yào)在37℃或(huò)更高(gāo)的溫度加(jiā)熱解凍
。應(yīng)在室溫(wēn)下解(jiě)凍並(bìng)確保(bǎo)樣(yàng)品(pǐn)均匀地(dì)充分解凍(dòng)
。

 
試劑(jì)的準(zhǔn)備(bèi)

1）標準品(pǐn)
：標準(zhǔn)品的(dí)係列稀釋(shì)應在實驗時準備，不能(néng)儲存
。稀釋前將(jiāng)標準(zhǔn)品振蕩混匀
。

2）洗滌緩(huǎn)衝(chōng)液（50×）的(dí)稀釋
：蒸餾(liù)水(shuǐ)50倍稀(xī)釋(shì)
。

 
操作步驟

1）使用前(qián)，將所有試劑充(chōng)分混匀
。不要(yào)使液體產生(shēng)大(dà)量的(dí)泡沫，以免加樣時(shí)加(jiā)入(rù)大(dà)量的氣泡(pào)，產生加樣上(shàng)的誤(wù)差(chà)
。

2）根(gēn)據(jù)待測樣(yàng)品(pǐn)數量加上標(biāo)準品(pǐn)的數(shù)量決定(dìng)所需的板(bǎn)條數(shù)
。每個(gè)標準(zhǔn)品和(hé)空(kōng)白孔建議(yì)做(zuò)復(fù)孔(kǒng)
。每個樣(yàng)品(pǐn)根據自(zì)己的數量來(lái)定，能使用復孔的盡(jìn)量做(zuò)復孔(kǒng)
。標本用標本稀釋(shì)液(yè)1
：1稀(xī)釋後加(jiā)入(rù)50ul於反應孔內(nèi)
。

3）加入稀釋(shì)好後(hòu)的標準(zhǔn)品(pǐn)50ul於反應孔(kǒng)
，加入待測(cè)樣(yàng)品50ul於反應孔(kǒng)內
。立即加(jiā)入50ul的生物(wù)素標(biāo)記(jì)的抗體(tǐ)
。蓋上(shàng)膜板，輕(qīng)輕(qīng)振蕩(dàng)混匀(yún)，37℃溫育(yù)1小(xiǎo)時(shí)
。

4）甩去孔(kǒng)內液體(tǐ)，每(měi)孔(kǒng)加(jiā)滿洗(xǐ)滌(dí)液(yè)，振蕩(dàng)30秒(miǎo)，甩(shuǎi)去洗滌液，用吸水紙(zhǐ)拍(pāi)幹
。重復此操作(zuò)3次
。如果(guǒ)用洗板機洗滌，洗滌次(cì)數(shù)增加(jiā)一次
。

5）每孔(kǒng)加入(rù)80ul的親(qīn)和鏈(liàn)酶素-HRP，輕輕(qīng)振蕩(dàng)混匀(yún)，37℃溫育30分(fēn)鐘
。

6）甩(shuǎi)去(qù)孔內(nèi)液(yè)體(tǐ)，每孔(kǒng)加滿(mǎn)洗滌液(yè)，振(zhèn)蕩30秒(miǎo)，甩去洗滌(dí)液，用(yòng)吸水(shuǐ)紙(zhǐ)拍(pāi)幹
。重復此操(cāo)作3次(cì)
。如(rú)果用(yòng)洗板機洗(xǐ)滌，洗(xǐ)滌(dí)次數(shù)增加(jiā)一次
。

7）每(měi)孔(kǒng)加(jiā)入底(dǐ)物(wù)A
，B各50ul，輕輕振(zhèn)蕩混匀，37℃溫育(yù)10分(fēn)鐘
。避(bì)免光照(zhào)
。

8）取(qǔ)出酶標板，迅(xùn)速(sù)加(jiā)入(rù)50ul終(zhōng)止(zhǐ)液，加入終(zhōng)止(zhǐ)液(yè)後(hòu)應(yīng)立(lì)即(jí)測定結果
。

9）在450nm波長處測(cè)定(dìng)各(gè)孔的(dí)OD值
。

 

局限(xiàn)

6號標準(zhǔn)品以(yǐ)上的(dí)結(jié)果(guǒ)為(wéi)非(fēi)綫性的，根(gēn)據此標(biāo)準曲綫(xiàn)無(wú)法(fǎ)得到精確的(dí)結果(guǒ)
。

 
性(xìng)能

1. 靈敏度
：最小的檢(jiǎn)測濃度小於1號(hào)標準品(pǐn)
。稀釋度(dù)的綫性(xìng)
。樣(yàng)品綫性(xìng)回(huí)歸與預期(qī)濃度相關係數(shù)R值(zhí)為(wéi)0.990
。

2. 特(tè)異性
：不與其它細(xì)胞因(yīn)子反應
。

3. 重復性
：板(bǎn)內
，板間(jiān)變(biàn)異(yì)係(xì)數均小於10%
。

 
結(jié)果(guǒ)判(pàn)斷與(yǔ)分析

1
，儀(yí)器(qì)值(zhí)
：於(yú)波長450nm的(dí)酶標(biāo)儀上(shàng)讀取(qǔ)各孔的OD值

2
，以吸光度OD值為縱坐標(biāo)（Y），相(xiāng)應(yīng)的待(dài)測(cè)物(wù)質(zhì)標準品濃度為橫坐標（X），做得(dé)相(xiāng)應(yīng)的(dí)曲(qū)綫，樣(yàng)品的(dí)待(dài)測(cè)物質含(hán)量(liáng)可(kě)根(gēn)據(jù)其OD值由(yóu)標(biāo)準曲(qū)綫換算出相應的(dí)濃(nóng)度
。

 
實驗(yàn)原理(lǐ): 用(yòng)純(chún)化(huà)的抗體包被(bèi)微(wēi)孔板，製成固相載(zǎi)體，往(wǎng)包被(bèi)抗體(tǐ)的微孔(kǒng)中依次(cì)加(jiā)入標本(běn)或(huò)者(zhě)標準(zhǔn)品(pǐn)
，生物素化的抗體
，HRP-標(biāo)記的(dí)親(qīn)和(hé)素(sù)，經過(guò)徹(chè)底洗滌(dí)後用底物顯色(sè)
。底(dǐ)物在(zài)過氧化物酶的催化下(xià)轉化成(chéng)藍色， 並在酸的作(zuò)用下轉化(huà)成最終(zhōng)的(dí)黃色(sè)
。 顏(yán)色的深(shēn)淺(qiǎn)和樣(yàng)品中的目標蛋(dàn)白(bái)呈(chéng)正相(xiāng)關
。用酶標儀在(zài)（450nm）波長下(xià)測定測定(dìng)OD值（吸光(guāng)度），計算樣品濃度
。