阿(ā)馬帕裏(lǐ)病(bìng)毒PCR檢(jiǎn)測(cè)試劑盒說(shuō)明(míng)書(shū)

使用方(fāng)法(fǎ)：

測定(dìng)法(fǎ)的靈(líng)敏度來(lái)自作為報(bào)告(gào)的酶。酶是一(yī)種(zhǒng)有(yǒu)機(jī)催(cuī)化(huà)劑，很(hěn)少量(liáng)的酶(méi)即(jí)可(kě)誘(yòu)導(dǎo)大(dà)量(liáng)的(dí)催(cuī)化反(fǎn)應(yīng)，產生(shēng)可(kě)供(gōng)觀(guān)察的顯色反應現(xiàn)象(xiàng)。因此該(gāi)體(tǐ)係(xì)常被稱為(wéi)酶(méi)放(fàng)大體(tǐ)係(xì)。

1. 標準(zhǔn)品(pǐn)的稀(xī)釋：本試(shì)劑(jì)盒(hé)提供(gōng)原(yuán)倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可(kě)按照下(xià)列圖表(biǎo)在小(xiǎo)試管(guǎn)中進行(háng)稀釋。   24μg/ml    5號(hào)標準品    150μl的(dí)原倍標準(zhǔn)品加入150μl標準品(pǐn)稀釋(shì)液

 12μg/ml    4號標(biāo)準品    150μl的5號標準品加入(rù)150μl標準(zhǔn)品(pǐn)稀釋液(yè)

 6μg/ml     3號(hào)標準品    150μl的(dí)4號標準(zhǔn)品加入(rù)150μl標準品稀釋(shì)液(yè)

 3μg/ml     2號標準品    150μl的3號標準品加入150μl標準(zhǔn)品(pǐn)稀(xī)釋液

 1.5μg/ml   1號標準品    150μl的2號(hào)標準品加(jiā)入(rù)150μl標(biāo)準(zhǔn)品(pǐn)稀(xī)釋液

2. 加樣(yàng)：分(fēn)別(bié)設空(kōng)白(bái)孔，標準(zhǔn)孔，待測樣(yàng)品孔(kǒng)。在(zài)酶(méi)標包被板(bǎn)上標(biāo)準品準(zhǔn)確加(jiā)樣50μl，待測樣品孔中先加樣(yàng)品稀(xī)釋液40μl，然後(hòu)再(zài)加待(dài)測(cè)樣品(pǐn)10μl（樣品終(zhōng)稀(xī)釋度為5倍）。加樣將(jiāng)樣品(pǐn)加(jiā)於(yú)酶標板(bǎn)孔底部，盡(jìn)量(liáng)不觸及孔壁，輕輕晃動混匀。|

3. 溫育：用(yòng)封(fēng)板膜封(fēng)板後(hòu)置37℃溫(wēn)育30分(fēn)鐘。   

4. 配液：將30倍濃(nóng)縮洗滌(dí)液用蒸餾(liù)水30倍稀釋後(hòu)備用

5. 洗滌：小(xiǎo)心揭掉封板膜，棄去(qù)液體，甩幹，每(měi)孔加(jiā)滿洗(xǐ)滌液，靜(jìng)置30秒後棄去，如此(cǐ)重復(fù)5次，拍幹(gān)。

6. 加酶(méi)：每孔加(jiā)入酶(méi)標試(shì)劑50μl，空(kōng)白孔除(chú)外。

7. 溫(wēn)育(yù)：操作(zuò)同(tóng)3。

8. 洗(xǐ)滌：操(cāo)作(zuò)同5。

9. 顯(xiǎn)色(sè)：每孔先(xiān)加(jiā)入(rù)顯色(sè)劑A50μl，再(zài)加入顯(xiǎn)色(sè)劑B50μl，輕輕(qīng)震蕩(dàng)混(hùn)匀，37℃避光顯色(sè)15分鐘(zhōng).

10. 終(zhōng)止：每孔加終(zhōng)止液50μl，終止反(fǎn)應（此(cǐ)時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃(huáng)色）。

11. 測定：以空白空(kōng)調(tiáo)零，450nm波長依(yī)序(xù)測(cè)量各孔(kǒng)的吸(xī)光度（OD值）。 測定應(yīng)在加終止液後(hòu)15分鐘(zhōng)以(yǐ)內(nèi)進行。

熒光定量PCR檢測方(fāng)法包括(kuò)以下(xià)步驟(zhòu)：

(1)將(jiāng)參照(zhào)基(jī)因(yīn)與(yǔ)待測(cè)目(mù)的基因(yīn)片段(duàn)等(děng)比例連接，克隆到(dào)同(tóng)一個質粒(lì)載體(tǐ)上，構(gòu)建(jiàn)一(yī)種(zhǒng)可同(tóng)時用於參照(zhào)基因以(yǐ)及(jí)待(dài)測目的(dí)基因擴增(zēng)檢測的(dí)標(biāo)準品(pǐn)，並將所(suǒ)得(dé)標(biāo)準(zhǔn)品按(àn)照濃度梯度稀釋後同時用於(yú)繪(huì)製參照(zhào)基(jī)因以及待(dài)測目的基因(yīn)的標(biāo)準曲(qū)綫；

(2)待測(cè)樣(yàng)本與步(bù)驟(zhòu)(1)所(suǒ)述標(biāo)準品經(jīng)同步進行實時(shí)熒(yíng)光定量PCR擴增後，目的(dí)基(jī)因與參照(zhào)基因(yīn)按照各自(zì)的(dí)標準曲(qū)綫(xiàn)計算(suàn)各自的拷(kǎo)貝(bèi)數(shù)，計算(suàn)待(dài)測樣本的目(mù)的基因與參(cān)照(zhào)基因(yīn)拷貝(bèi)數(shù)比值(zhí)，即得目的基(jī)因(yīn)的拷貝數相對(duì)定量檢(jiǎn)測(cè)結果。

其(qí)中(zhōng)步(bù)驟(1)為：將參照(zhào)基因與(yǔ)待(dài)測(cè)目的(dí)基因片(piàn)段等比例(lì)連(lián)接(jiē)，克隆(lóng)到同一個(gè)質(zhì)粒載(zǎi)體(tǐ)上(shàng)，構建一種可(kě)同時(shí)用(yòng)於(yú)參照基(jī)因(yīn)以(yǐ)及(jí)待測目(mù)的基(jī)因(yīn)擴(kuò)增檢(jiǎn)測(cè)的標準品(pǐn)，並將所(suǒ)得標準品(pǐn)按照濃度(dù)梯度稀(xī)釋後同時(shí)用於繪製參照基(jī)因以(yǐ)及(jí)待測目的(dí)基(jī)因的(dí)標準曲綫(xiàn)。

其(qí)中(zhōng)所(suǒ)述參照基(jī)因(yīn)為本(běn)領域(yù)常規(guī)參照基因，較佳地(dì)管家基(jī)因(yīn)，地為RPPH1的(dí)擴(kuò)增區域(yù)，其中(zhōng)所述質粒(lì)載體為(wéi)本領(lǐng)域常規(guī)質(zhì)粒載(zǎi)體(tǐ)，較佳地(dì)為PCR克隆載體，地(dì)為(wéi)TA cloning載(zǎi)體，所(suǒ)述(shù)TA cloning載體較佳地(dì)為(wéi)pMD18-T載(zǎi)體。其中所(suǒ)述標(biāo)準品(pǐn)的(dí)核酸序(xù)列如(rú)序(xù)列表中SEQ ID NO:6所(suǒ)示。所述的等(děng)比例較佳地為1：1。由於(yú)標準品(pǐn)中待(dài)測(cè)目的(dí)基(jī)因與參(cān)照基因的比(bǐ)例(lì)為(wéi)1:1，解決了目前相對標(biāo)準曲(qū)綫法(fǎ)應(yīng)用(yòng)中目(mù)的基(jī)因與(yǔ)參照基(jī)因(yīn)的濃(nóng)度比例關係難(nán)以(yǐ)控製的問題，提高HER2基(jī)因擴增(zēng)檢(jiǎn)測(cè)的(dí)可靠性(xìng)。

步(bù)驟(2)為(wéi)：待測(cè)樣本與(yǔ)步驟(zhòu)(1)所述標(biāo)準(zhǔn)品經同步進行(háng)實(shí)時(shí)熒光(guāng)定(dìng)量(liáng)PCR擴增後(hòu)，目的基因與(yǔ)參照基因按(àn)照各(gè)自的(dí)標準曲綫計(jì)算各自的(dí)拷(kǎo)貝數，計算待測(cè)樣本的目(mù)的基(jī)因(yīn)與參照基因拷貝數比值(zhí)，即得目的基(jī)因的拷(kǎo)貝數(shù)相(xiāng)對定(dìng)量(liáng)檢測(cè)結果(guǒ)。

其中所(suǒ)述(shù)待測目的(dí)基因為本(běn)領(lǐng)域常規(guī)待(dài)測(cè)目的基(jī)因，較佳地為腫(zhǒng)瘤或者疾(jí)病的特(tè)異性基(jī)因，更(gēng)佳(jiā)地為(wéi)HER2基(jī)因(yīn)的擴(kuò)增區(qū)域(yù)，所述熒(yíng)光定(dìng)量PCR擴(kuò)增為(wéi)本領域(yù)常(cháng)規熒光(guāng)定量(liáng)PCR擴增(zēng)方法，所述(shù)熒(yíng)光(guāng)定量(liáng)PCR擴增(zēng)方法(fǎ)較(jiào)佳地(dì)為多(duō)通道熒光定(dìng)量PCR擴(kuò)增，更(gēng)佳地為(wéi)雙(shuāng)通道熒(yíng)光定量(liáng)PCR擴增(zēng)。

實驗規則：

1，要保(bǎo)證移(yí)液槍(qiāng)的(dí)準(zhǔn)確性，誤差(chà)不能(néng)超過2%。可(kě)用水和(hé)電(diàn)子(zǐ)天平(píng)進行確定。但有專業(yè)人員(yuán)進行(háng)矯正(zhèng)。

2，要配備20ul，50ul，100ul，1000ul和排槍(qiāng)各一(yī)支。吸取不同的(dí)液體後，要更(gēng)換(huàn)槍頭。即使(shǐ)是(shì)吸取標準品時(shí)。

3，要在(zài)實驗前1小(xiǎo)時(shí)將試劑(jì)盒從(cóng)冰(bīng)箱中取出(chū)，使各(gè)種試(shì)劑(jì)都恢(huī)復到室(shì)溫(wēn)，以使結果更(gēng)穩(wěn)定(dìng)。

4，實(shí)驗(yàn)時，要使(shǐ)底物避光(guāng)保存。

5，用(yòng)槍(qiāng)吸(xī)取(qǔ)液體時速(sù)度(dù)不能(néng)太(tài)快，以免產生氣(qì)泡(pào)而(ér)使吸(xī)取量(liáng)不(bù)準確。

6，吸(xī)取(qǔ)液(yè)體(tǐ)時(shí)，要用量程和需(xū)要(yào)量接近的(dí)槍去吸，減少誤差(chà)。

7，將(jiāng)液體加到酶(méi)標(biāo)孔(kǒng)中(zhōng)時(shí)，避免槍(qiāng)頭(tóu)和(hé)孔內(nèi)液(yè)體(tǐ)接(jiē)觸，可使槍(qiāng)頭(tóu)上(shàng)的液(yè)滴和(hé)孔(kǒng)壁(bì)接觸(chù)，液(yè)滴(dī)會自然(rán)流下去。

8，液體(tǐ)全部(bù)加(jiā)完(wán)後，可(kě)將酶標(biāo)板在(zài)桌子(zǐ)上(shàng)平行(háng)輕(qīng)輕(qīng)晃動(dòng)30秒，混(hùn)匀液體。也(yě)可(kě)以用(yòng)酶標儀的晃動功能。

9，應(yīng)盡(jìn)量做(zuò)雙孔(kǒng)實驗，這(zhè)樣才能保證數據的準確性(xìng)。

10，對結果有疑(yí)問(wèn)的(dí)樣(yàng)品要用(yòng)其(qí)它方(fāng)法進行(háng)確證(zhèng)。

實驗注(zhù)意事項：

1）RT-PCR可(kě)以檢測(cè)組織(zhī)，細(xì)胞，血(xiě)液，細(xì)菌等很多(duō)材料(liào)，不同(tóng)的樣(yàng)本有不同(tóng)要(yào)求(qiú)，實驗前(qián)請充分溝(gōu)通確認(rèn)實驗方案和(hé)樣本情(qíng)況；

2）客戶盡可能提(tí)供(gōng)實驗的背景信(xìn)息(xī)，物(wù)種，基因準確的(dí)名(míng)稱(chēng)和ID號(hào)；

3）客戶盡量(liáng)不要(yào)提(tí)供(gōng)DNA或RNA樣(yàng)品(pǐn)。

4）樣(yàng)本保存(cún)於液氮(dàn)或幹(gān)冰(bīng)，也可以保存於(yú)Trizol液(yè)中。

實時(shí)熒(yíng)光(guāng)定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是指(zhǐ)在(zài)PCR反(fǎn)應體(tǐ)係(xì)中(zhōng)加入(rù)熒(yíng)光基(jī)團，利用熒光信號積(jī)累實時監(jiān)測(cè)整(zhěng)個PCR進程，*通過(guò)標(biāo)準曲綫對未(wèi)知模板(bǎn)進行(háng)定(dìng)量(liáng)分析(xī)的(dí)方法。實時(shí)熒(yíng)光定量(liáng)PCR的化學原理包括(kuò)探針(zhēn)類(lèi)和非探針(zhēn)類兩(liǎng)類(lèi)，探針類(lèi)是利用與靶細(xì)胞(bāo)序列特(tè)異性雜(zá)交(jiāo)的(dí)探針來指示擴增產物的增加(jiā)，非探針(zhēn)類是利(lì)用熒(yíng)光染(rǎn)料(liào)或者特異(yì)性設計的(dí)引物來指(zhǐ)示擴增的增加(jiā)。運(yùn)用該技術可(kě)以(yǐ)對DNA，RNA樣品進(jìn)行定(dìng)量（包括*定量(liáng)和(hé)相(xiāng)對定量）和(hé)定性分(fēn)析。

主要服(fú)務(wù)：DNA或RNA的*定量分析，基因(yīn)表達差異(yì)分析，基因分(fēn)型(xíng)。

主要技術：引物(wù)設計，RNA提(tí)取，cDNA合(hé)成(chéng)，qPCR。